Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai iegūtu labākos rezultātus, iesakām izmantot jaunāku pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiks attēlota bez stiliem un JavaScript.
Modisko izmaiņu (MC) dzīvnieku modeļu izveide ir svarīgs pamats MC pētīšanai. Piecdesmit četri Jaunzēlandes baltie truši tika iedalīti placebo operāciju grupā, muskuļu implantācijas grupā (ME grupa) un nucleus pulposus implantācijas grupā (NPE grupa). NPE grupā starpskriemeļu disks tika atsegts ar anterolaterālu jostas daļas ķirurģisku pieeju, un ar adatu tika caurdurts L5 skriemeļa ķermenis pie gala plāksnes. NP tika izvilkts no L1/2 starpskriemeļu diska ar šļirci un injicēts tajā. Tika izurbts caurums subhondrālajā kaulā. Ķirurģiskās procedūras un urbšanas metodes muskuļu implantācijas grupā un placebo operāciju grupā bija tādas pašas kā NP implantācijas grupā. ME grupā caurumā tika ievietots muskuļa gabals, savukārt placebo operāciju grupā caurumā nekas netika ievietots. Pēc operācijas tika veikta MRI skenēšana un molekulārā bioloģiskā testēšana. Signāls NPE grupā mainījās, bet placebo operāciju grupā un ME grupā nebija acīmredzamu signāla izmaiņu. Histoloģiskajā novērošanā tika novērota patoloģiska audu proliferācija implantācijas vietā, un NPE grupā bija palielināta IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija. NP implantācija subhondrālajā kaulā var veidot MC dzīvnieku modeli.
Modiskās izmaiņas (MK) ir skriemeļu gala plāksnīšu un blakus esošo kaulu smadzeņu bojājumi, kas redzami magnētiskās rezonanses attēlveidošanā (MRI). Tās ir diezgan izplatītas cilvēkiem ar saistītiem simptomiem1. Daudzos pētījumos ir uzsvērta MK nozīme tās saistības ar muguras lejasdaļas sāpēm (LBP)2,3 dēļ. de Roos et al.4 un Modic et al.5 neatkarīgi pirmie aprakstīja trīs dažādus subhondrālā signāla anomāliju veidus skriemeļu kaulu smadzenēs. Modiskās I tipa izmaiņas ir hipointensas T1 svērtajās (T1W) sekvencēs un hiperintensas T2 svērtajās (T2W) sekvencēs. Šis bojājums atklāj fisūru gala plāksnītes un blakus esošos asinsvadu granulācijas audus kaulu smadzenēs. Modiskās II tipa izmaiņas uzrāda augstu signālu gan T1W, gan T2W sekvencēs. Šāda veida bojājumā var konstatēt gala plāksnīšu bojājumus, kā arī blakus esošo kaulu smadzeņu histoloģisku taukainu aizvietošanu. Modiskās III tipa izmaiņas uzrāda zemu signālu T1W un T2W sekvencēs. Ir novēroti sklerotiski bojājumi, kas atbilst gala plāksnītēm6. MC tiek uzskatīta par mugurkaula patoloģisku slimību un ir cieši saistīta ar daudzām deģeneratīvām mugurkaula slimībām7,8,9.
Ņemot vērā pieejamos datus, vairāki pētījumi ir snieguši detalizētu ieskatu MC etioloģijā un patoloģiskajos mehānismos. Alberts un līdzautori ieteica, ka MC var izraisīt diska trūce8. Hu un līdzautori MC attiecināja uz smagu diska deģenerāciju10. Krocs ierosināja "iekšējā diska plīsuma" jēdzienu, kas apgalvo, ka atkārtota diska trauma var izraisīt mikroplīsumus gala plāksnītē. Pēc spraugas veidošanās gala plāksnes iznīcināšana ar nucleus pulposus (NP) palīdzību var izraisīt autoimūnu reakciju, kas vēl vairāk noved pie MC11 attīstības. Ma un līdzautori pauda līdzīgu viedokli un ziņoja, ka NP izraisītai autoimunitātei ir galvenā loma MC12 patogenezē.
Imūnās sistēmas šūnām, īpaši CD4+ T helperlimfocītiem, ir izšķiroša nozīme autoimunitātes patoģenēzē13. Nesen atklātā Th17 apakškopa ražo iekaisumu veicinošu citokīnu IL-17, veicina hemokīnu ekspresiju un stimulē bojāto orgānu T šūnas producēt IFN-γ14. Arī Th2 šūnām ir unikāla loma imūnreakciju patoģenēzē. IL-4 ekspresija kā reprezentatīva Th2 šūna var izraisīt nopietnas imunopatoloģiskas sekas15.
Lai gan ir veikti daudzi klīniskie pētījumi par MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, joprojām trūkst piemērotu dzīvnieku eksperimentālo modeļu, kas varētu atdarināt cilvēkiem bieži notiekošo MC procesu un ko varētu izmantot etioloģijas vai jaunu ārstēšanas metožu, piemēram, mērķterapijas, izpētei. Līdz šim ir ziņots tikai par dažiem MC dzīvnieku modeļiem, kas pēta pamatā esošos patoloģiskos mehānismus.
Balstoties uz Alberta un Ma piedāvāto autoimūno teoriju, šajā pētījumā tika izveidots vienkāršs un reproducējams truša MC modelis, autotransplantējot NP netālu no urbtās skriemeļa gala plāksnes. Citi mērķi ir novērot dzīvnieku modeļu histoloģiskās īpašības un novērtēt NP specifiskos mehānismus MC attīstībā. Šajā nolūkā mēs izmantojam tādas metodes kā molekulārā bioloģija, MRI un histoloģiskie pētījumi, lai pētītu MC progresēšanu.
Divi truši nomira no asiņošanas operācijas laikā, un četri truši nomira anestēzijas laikā MRI laikā. Atlikušie 48 truši izdzīvoja un pēc operācijas neuzrādīja nekādas uzvedības vai neiroloģiskas pazīmes.
MRI rāda, ka iegulto audu signāla intensitāte dažādos caurumos ir atšķirīga. NPE grupā L5 skriemeļa ķermeņa signāla intensitāte pakāpeniski mainījās 12, 16 un 20 nedēļas pēc ievietošanas (T1W secība uzrādīja vāju signālu, bet T2W secība uzrādīja jauktu signālu ar vāju signālu) (1.C att.), savukārt pārējo divu iegulto daļu grupu MRI izskats tajā pašā laika posmā saglabājās relatīvi stabils (1.A, B att.).
(A) Reprezentatīvi secīgi truša jostas daļas MRI attēli 3 laika punktos. Kontroloperācijas grupas attēlos signāla anomālijas netika konstatētas. (B) ME grupas skriemeļa ķermeņa signāla raksturlielumi ir līdzīgi kā kontrolloperācijas grupā, un iegulšanas vietā laika gaitā nav novērotas būtiskas signāla izmaiņas. (C) NPE grupā zemais signāls ir skaidri redzams T1W secībā, un jauktais signāls un zemais signāls ir skaidri redzami T2W secībā. No 12 nedēļu perioda līdz 20 nedēļu periodam sporādiskie augstie signāli ap zemajiem signāliem T2W secībā samazinās.
NPE grupā skriemeļa ķermeņa implantācijas vietā var novērot acīmredzamu kaulu hiperplāziju, un kaulu hiperplāzija notiek ātrāk no 12 līdz 20 nedēļām (2.C att.), salīdzinot ar NPE grupu; modelētajos skriemeļu ķermeņos būtiskas izmaiņas nav novērotas; Sham grupa un ME grupa (2.C att. 2A,B).
(A) Skriemeļa ķermeņa virsma implantētajā daļā ir ļoti gluda, caurums labi dzīst, un skriemeļa ķermenī nav hiperplāzijas. (B) ME grupas implantētās vietas forma ir līdzīga tai, kas tika veikta pēc simulētas operācijas, un laika gaitā nav acīmredzamu izmaiņu implantētās vietas izskatā. (C) NPE grupā implantētajā vietā radās kaulu hiperplāzija. Kaulu hiperplāzija strauji palielinājās un pat izplatījās caur starpskriemeļu disku līdz kontralaterālajam skriemeļa ķermenim.
Histoloģiskā analīze sniedz detalizētāku informāciju par kaulu veidošanos. 3. attēlā redzamas pēcoperācijas griezumu fotogrāfijas, kas iekrāsotas ar H&E. Fiziskās operācijas grupā hondrocīti bija labi sakārtoti, un šūnu proliferācija netika konstatēta (3.A att.). Situācija ME grupā bija līdzīga tai, kas bija simulētās operācijas grupā (3.B att.). Tomēr NPE grupā implantācijas vietā tika novērots liels skaits hondrocītu un NP līdzīgu šūnu proliferācija (3.C att.);
(A) Blakus gala plāksnei var redzēt trabekulas, hondrocīti ir glīti izvietoti ar vienādu šūnu izmēru un formu, un nav proliferācijas (40 reizes). (B) Implantācijas vietas stāvoklis ME grupā ir līdzīgs placebo grupas stāvoklim. Var redzēt trabekulas un hondrocītus, bet implantācijas vietā nav acīmredzamas proliferācijas (40 reizes). (B) Var redzēt, ka hondrocīti un NP līdzīgās šūnas ievērojami proliferējas, un hondrocītu forma un izmērs ir nevienmērīgs (40 reizes).
Gan NPE, gan ME grupās tika novērota interleikīna 4 (IL-4) mRNS, interleikīna 17 (IL-17) mRNS un interferona γ (IFN-γ) mRNS ekspresija. Salīdzinot mērķa gēnu ekspresijas līmeņus, IL-4, IL-17 un IFN-γ gēnu ekspresija NPE grupā bija ievērojami palielināta, salīdzinot ar ME grupu un placebo operācijas grupu (4. att.) (P < 0,05). Salīdzinot ar placebo operācijas grupu, IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresijas līmeņi ME grupā palielinājās tikai nedaudz un nesasniedza statistiskas izmaiņas (P > 0,05).
IL-4, IL-17 un IFN-γ mRNS ekspresija NPE grupā uzrādīja ievērojami augstāku tendenci nekā placebo operācijas grupā un ME grupā (P < 0,05).
Turpretī ME grupas ekspresijas līmeņi neuzrādīja būtisku atšķirību (P>0,05).
Lai apstiprinātu izmainīto mRNS ekspresijas modeli, tika veikta Western blot analīze, izmantojot komerciāli pieejamas antivielas pret IL-4 un IL-17. Kā parādīts 5.A un 5.B attēlā, salīdzinot ar ME grupu un placebo operācijas grupu, IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis NPE grupā bija ievērojami paaugstināts (P < 0,05). Salīdzinot ar placebo operācijas grupu, arī ME grupā IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis nesasniedza statistiski nozīmīgas izmaiņas (P > 0,05).
(A) IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis NPE grupā bija ievērojami augstāks nekā ME grupā un placebo grupā (P < 0,05). (B) Western blot histogramma.
Ierobežotā ķirurģisko procedūru laikā iegūto cilvēku paraugu skaita dēļ skaidru un detalizētu MC patogenēzes pētījumu veikšana ir nedaudz sarežģīta. Mēs centāmies izveidot MC dzīvnieku modeli, lai pētītu tā iespējamos patoloģiskos mehānismus. Vienlaikus tika izmantota radioloģiskā izmeklēšana, histoloģiskā izmeklēšana un molekulārā bioloģiskā izmeklēšana, lai izsekotu NP autotransplantāta izraisītas MC gaitai. Rezultātā NP implantācijas modelis izraisīja pakāpeniskas signāla intensitātes izmaiņas no 12 līdz 20 nedēļu laika punktiem (jaukts zems signāls T1W sekvencēs un zems signāls T2W sekvencēs), norādot uz audu izmaiņām, un histoloģiskā un molekulārā bioloģiskā izmeklēšana apstiprināja radioloģiskā pētījuma rezultātus.
Šī eksperimenta rezultāti liecina, ka NPE grupā skriemeļa ķermeņa bojājuma vietā radās vizuālas un histoloģiskas izmaiņas. Vienlaikus tika novērota IL-4, IL-17 un IFN-γ gēnu, kā arī IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija, kas norāda, ka autologā nucleus pulposus audu bojājums skriemeļa ķermenī var izraisīt virkni signāla un morfoloģisku izmaiņu. Ir viegli secināt, ka dzīvnieku modeļa skriemeļu ķermeņu signāla raksturlielumi (zems signāls T1W secībā, jaukts signāls un zems signāls T2W secībā) ir ļoti līdzīgi cilvēka skriemeļu šūnu raksturlielumiem, un MRI raksturlielumi apstiprina arī histoloģijas un makroskopiskās anatomijas novērojumus, tas ir, izmaiņas skriemeļa ķermeņa šūnās ir progresējošas. Lai gan akūtas traumas izraisīta iekaisuma reakcija var parādīties drīz pēc punkcijas, MRI rezultāti parādīja, ka progresīvi pieaugošas signāla izmaiņas parādījās 12 nedēļas pēc punkcijas un saglabājās līdz pat 20 nedēļām bez jebkādām atveseļošanās vai MRI izmaiņu atgriezeniskuma pazīmēm. Šie rezultāti liecina, ka autologa skriemeļu NP ir uzticama metode progresējošas MV noteikšanai trušiem.
Šim punkcijas modelim ir nepieciešamas atbilstošas prasmes, laiks un ķirurģiskas pūles. Sākotnējos eksperimentos paravertebrālo saišu struktūru preparēšana vai pārmērīga stimulācija var izraisīt skriemeļu osteofītu veidošanos. Jāuzmanās, lai nebojātu vai nekairinātu blakus esošos diskus. Tā kā, lai iegūtu konsekventus un reproducējamus rezultātus, ir jākontrolē iespiešanās dziļums, mēs manuāli izgatavojām aizbāzni, nogriežot 3 mm garas adatas apvalku. Šī aizbāžņa izmantošana nodrošina vienmērīgu urbšanas dziļumu skriemeļa ķermenī. Sākotnējos eksperimentos trīs operācijā iesaistītie ortopēdiskie ķirurgi atklāja, ka ar 16. izmēra adatām ir vieglāk strādāt nekā ar 18. izmēra adatām vai citām metodēm. Lai urbšanas laikā izvairītos no pārmērīgas asiņošanas, adatas turēšana nekustīgi kādu laiku nodrošinās piemērotāku ievietošanas atveri, kas liecina, ka šādā veidā var kontrolēt zināmu MC pakāpi.
Lai gan daudzi pētījumi ir vērsti uz MC, par MC etioloģiju un patogenēzi ir maz zināms25,26,27. Pamatojoties uz mūsu iepriekšējiem pētījumiem, mēs atklājām, ka autoimunitātei ir galvenā loma MC12 rašanās un attīstības procesā. Šajā pētījumā tika pētīta IL-4, IL-17 un IFN-γ kvantitatīvā ekspresija, kas ir galvenie CD4+ šūnu diferenciācijas ceļi pēc antigēna stimulācijas. Mūsu pētījumā, salīdzinot ar negatīvo grupu, NPE grupai bija augstāka IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija, un arī IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis bija augstāks.
Klīniski IL-17 mRNS ekspresija ir palielināta NP šūnās pacientiem ar diska trūci28. Paaugstināts IL-4 un IFN-γ ekspresijas līmenis tika konstatēts arī akūtā nekompresīvā diska trūces modelī, salīdzinot ar veseliem kontroles subjektiem29. IL-17 ir galvenā loma iekaisumā, audu bojājumos autoimūnās slimībās30 un pastiprina imūnreakciju pret IFN-γ31. Pastiprināts IL-17 mediēts audu bojājums ir ziņots MRL/lpr pelēm32 un autoimunitātei jutīgām pelēm33. IL-4 var inhibēt proinflamatorisku citokīnu (piemēram, IL-1β un TNFα) ekspresiju un makrofāgu aktivāciju34. Tika ziņots, ka IL-4 mRNS ekspresija NPE grupā atšķīrās salīdzinājumā ar IL-17 un IFN-γ vienā un tajā pašā laika punktā; IFN-γ mRNS ekspresija NPE grupā bija ievērojami augstāka nekā citās grupās. Tādēļ IFN-γ ražošana var būt NP interkalācijas izraisītas iekaisuma reakcijas mediators. Pētījumi liecina, ka IFN-γ ražo vairāki šūnu tipi, tostarp aktivētas 1. tipa T helperšūnas, dabiskās killeršūnas un makrofāgi35,36, un tas ir galvenais iekaisumu veicinošais citokīns, kas veicina imūnās atbildes37.
Šis pētījums liecina, ka MC rašanās un attīstība var būt saistīta ar autoimūnu reakciju. Luoma et al. atklāja, ka MC un izteiktas NP signāla raksturlielumi MRI ir līdzīgi, un abi uzrāda augstu signālu T2W secībā38. Ir apstiprināts, ka daži citokīni ir cieši saistīti ar MC rašanos, piemēram, IL-139. Ma et al. ieteica, ka NP izvirzījums uz augšu vai uz leju var būtiski ietekmēt MC12 rašanos un attīstību. Bobechko40 un Herzbein et al.41 ziņoja, ka NP ir imūntoleranti audi, kas nevar iekļūt asinsvadu asinsritē no dzimšanas brīža. NP izvirzījumi ievada svešķermeņus asinsapgādē, tādējādi izraisot lokālas autoimūnas reakcijas42. Autoimūnas reakcijas var izraisīt lielu skaitu imūnfaktoru, un, ja šie faktori tiek nepārtraukti pakļauti audiem, tie var izraisīt signālu izmaiņas43. Šajā pētījumā IL-4, IL-17 un IFN-γ pārekspresija ir tipiski imūnfaktori, kas vēl vairāk pierāda ciešo saistību starp NP un MC44. Šis dzīvnieku modelis labi atdarina NP izrāvienu un iekļūšanu gala plāksnē. Šis process vēl vairāk atklāja autoimunitātes ietekmi uz MC.
Kā paredzēts, šis dzīvnieku modelis sniedz mums iespējamu platformu MC pētīšanai. Tomēr šim modelim joprojām ir daži ierobežojumi: pirmkārt, dzīvnieku novērošanas fāzē daži starpposma truši ir jāeitanizē histoloģiskiem un molekulārās bioloģijas testiem, tāpēc daži dzīvnieki laika gaitā "izkrīt no lietošanas". Otrkārt, lai gan šajā pētījumā ir noteikti trīs laika punkti, diemžēl mēs modelējām tikai vienu MC veidu (Modic I tipa izmaiņas), tāpēc ar to nepietiek, lai attēlotu cilvēka slimības attīstības procesu, un ir jānosaka vairāk laika punktu, lai labāk novērotu visas signālu izmaiņas. Treškārt, audu struktūras izmaiņas patiešām var skaidri parādīt ar histoloģisko krāsošanu, taču dažas specializētas metodes var labāk atklāt mikrostrukturālās izmaiņas šajā modelī. Piemēram, polarizētās gaismas mikroskopija tika izmantota, lai analizētu fibroskrimšļa veidošanos trušu starpskriemeļu diskos45. NP ilgtermiņa ietekme uz MC un gala plāksni ir jāturpina pētīt.
Piecdesmit četri Jaunzēlandes baltie truši (svars aptuveni 2,5–3 kg, vecums 3–3,5 mēneši) tika nejauši sadalīti placebo operāciju grupā, muskuļu implantācijas grupā (ME grupa) un nervu saknīšu implantācijas grupā (NPE grupa). Visas eksperimentālās procedūras apstiprināja Tjaņdziņas slimnīcas ētikas komiteja, un eksperimentālās metodes tika veiktas stingrā saskaņā ar apstiprinātajām vadlīnijām.
S. Sobadžimas ķirurģiskajā tehnikā ir veikti daži uzlabojumi46. Katrs trusis tika novietots sāniski guļus stāvoklī, un piecu secīgu jostas starpskriemeļu disku (IVD) priekšējā virsma tika atsegta, izmantojot posterolaterālu retroperitoneālu pieeju. Katram trusim tika ievadīta vispārējā anestēzija (20% uretāns, 5 ml/kg caur auss vēnu). No ribu apakšējās malas līdz iegurņa malai tika veikts garenisks ādas iegriezums, 2 cm ventrāli no paravertebrāliem muskuļiem. Labās anterolaterālās mugurkaula daļas no L1 līdz L6 tika atsegtas, veicot asu un neasu virsējo zemādas audu, retroperitoneālo audu un muskuļu preparēšanu (6A. att.). Diska līmenis tika noteikts, izmantojot iegurņa malu kā anatomisku orientieri L5-L6 diska līmenim. Izmantojiet 16. izmēra punkcijas adatu, lai izurbtu caurumu L5 skriemeļa gala plāksnes tuvumā 3 mm dziļumā (6B. att.). Izmantojiet 5 ml šļirci, lai aspirētu autologo nucleus pulposus L1-L2 starpskriemeļu diskā (6.C att.). Izņemiet nucleus pulposus vai muskuli atbilstoši katras grupas prasībām. Pēc urbuma padziļināšanas uz dziļās fascijas, virspusējās fascijas un ādas tiek uzliktas absorbējošas šuves, operācijas laikā nebojājot skriemeļa ķermeņa periosteālos audus.
(A) L5–L6 disks tiek atsegts, izmantojot posterolaterālu retroperitoneālu pieeju. (B) Izmantojot 16. izmēra adatu, izurbiet caurumu netālu no L5 gala plāksnes. (C) Tiek iegūtas autologās MF.
Vispārējā anestēzija tika veikta ar 20% uretānu (5 ml/kg), kas tika ievadīts caur auss vēnu, un jostas daļas mugurkaula rentgenogrammas tika atkārtotas 12, 16 un 20 nedēļas pēc operācijas.
Truši tika nogalināti, intramuskulāri injicējot ketamīnu (25,0 mg/kg) un intravenozi nātrija pentobarbitālu (1,2 g/kg) 12, 16 un 20 nedēļas pēc operācijas. Histoloģiskai analīzei tika noņemta visa mugurkaula daļa un veikta reāla analīze. Imūnfaktoru izmaiņu noteikšanai tika izmantota kvantitatīvā reversā transkripcija (RT-qPCR) un Western blotēšana.
MRI izmeklējumi trušiem tika veikti, izmantojot 3,0 T klīnisko magnētu (GE Medical Systems, Florence, SC), kas aprīkots ar ortogonālu ekstremitāšu spoles uztvērēju. Truši tika anestēti ar 20% uretānu (5 ml/kg) caur auss vēnu un pēc tam novietoti guļus magnētā, jostasvietu centrējot uz 5 collu diametra apļveida virsmas spoles (GE Medical Systems). Tika iegūti koronāli T2 svērti lokalizatora attēli (TR, 1445 ms; TE, 37 ms), lai noteiktu jostas diska atrašanās vietu no L3–L4 līdz L5–L6. Sagitālās plaknes T2 svērtie šķēles tika iegūtas ar šādiem iestatījumiem: ātra spina atbalss secība ar atkārtošanās laiku (TR) 2200 ms un atbalss laiku (TE) 70 ms, matrica; redzes lauks 260 un astoņi stimuli; griešanas biezums bija 2 mm, atstarpe bija 0,2 mm.
Pēc pēdējās fotogrāfijas uzņemšanas un pēdējā truša nogalināšanas simulācijas diski, muskuļos iestrādātie diski un NP diski tika izņemti histoloģiskai izmeklēšanai. Audi tika fiksēti 10% neitrālā buferētā formalīnā 1 nedēļu, atkaļķoti ar etilēndiamīntetraetiķskābi un sagriezti parafīna šķērsgriezumos. Audu bloki tika iestrādāti parafīnā un, izmantojot mikrotomu, sagriezti sagitālos griezumos (5 μm biezumā). Sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E).
Pēc starpskriemeļu disku savākšanas no katras grupas trušiem, kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot UNIQ-10 kolonnu (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem un ImProm II reversās transkripcijas sistēmu (Promega Inc., Madison, WI, ASV). Tika veikta reversā transkripcija.
RT-qPCR tika veikta, izmantojot Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ASV) un SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. PCR reakcijas tilpums bija 20 μl un saturēja 1,5 μl atšķaidītas kDNS un 0,2 μM katra primera. Primerus izstrādāja OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) un ražoja Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Ķīna) (1. tabula). Tika izmantoti šādi termiskās ciklēšanas apstākļi: sākotnējais polimerāzes aktivācijas solis 94°C temperatūrā 2 minūtes, pēc tam 40 cikli pa 15 s katrs 94°C temperatūrā matricas denaturēšanai, atkvēlināšana 1 minūti 60°C temperatūrā, ekstensija un fluorescence. Mērījumi tika veikti 1 minūti 72°C temperatūrā. Visi paraugi tika amplificēti trīs reizes, un vidējā vērtība tika izmantota RT-qPCR analīzei. Amplifikācijas dati tika analizēti, izmantojot FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ASV). IL-4, IL-17 un IFN-γ gēnu ekspresija tika normalizēta attiecībā pret endogēno kontroli (ACTB). Mērķa mRNS relatīvie ekspresijas līmeņi tika aprēķināti, izmantojot 2-ΔΔCT metodi.
Kopējais olbaltumvielu daudzums tika ekstrahēts no audiem, izmantojot audu homogenizatoru RIPA līzes buferšķīdumā (kas satur proteāzes un fosfatāzes inhibitoru kokteili), un pēc tam centrifugēts ar ātrumu 13 000 apgr./min 20 minūtes 4°C temperatūrā, lai atdalītu audu atliekas. Katrā joslā tika ielādēti piecdesmit mikrogrami olbaltumvielu, atdalīti ar 10% SDS-PAGE un pēc tam pārvietoti uz PVDF membrānu. Bloķēšana tika veikta 5% vājpiena sausā pienā Tris buferšķīdumā (TBS), kas satur 0,1% Tween 20, 1 stundu istabas temperatūrā. Membrānu inkubēja ar truša antidekorīna primāro antivielu (atšķaidītu 1:200; Boster, Uhaņa, Ķīna) (atšķaidītu 1:200; Bioss, Pekina, Ķīna) nakti 4°C temperatūrā un otrajā dienā reaģēja ar sekundāro antivielu (kazas anti-truša imūnglobulīns G atšķaidījumā 1:40 000) kombinācijā ar mārrutku peroksidāzi (Boster, Uhaņa, Ķīna) 1 stundu istabas temperatūrā. Western blot signāli tika noteikti ar palielinātu ķīmisko luminiscenci uz ķīmisko luminiscējošo membrānu pēc rentgena apstarošanas. Densitometriskai analīzei bloti tika skenēti un kvantificēti, izmantojot BandScan programmatūru, un rezultāti tika izteikti kā mērķa gēnu imunoreaktivitātes attiecība pret tubulīna imunoreaktivitāti.
Statistiskie aprēķini tika veikti, izmantojot SPSS16.0 programmatūras pakotni (SPSS, ASV). Pētījuma laikā apkopotie dati tika izteikti kā vidējais rādītājs ± standartnovirze (vidējais rādītājs ± SD) un analizēti, izmantojot vienvirziena atkārtotu mērījumu dispersijas analīzi (ANOVA), lai noteiktu atšķirības starp abām grupām. P < 0,05 tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.
Tādējādi MC dzīvnieku modeļa izveide, implantējot autologas NP skriemeļa ķermenī un veicot makroanatomisku novērošanu, MRI analīzi, histoloģisko novērtējumu un molekulāro bioloģisko analīzi, var kļūt par svarīgu instrumentu cilvēka MC mehānismu novērtēšanai un izpratnei, kā arī jaunu terapeitisku iejaukšanos izstrādei.
Kā citēt šo rakstu: Han, C. et al. Modic izmaiņu dzīvnieku modelis tika izveidots, implantējot autologu nucleus pulposus jostas daļas subhondrālajā kaulā. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. un Boos, N. Jostas daļas magnētiskās rezonanses attēlveidošana: diska trūces un aiztures, nervu saknīšu kompresijas, gala plāksnes anomāliju un fasešu locītavas osteoartrīta izplatība asimptomātiskiem brīvprātīgajiem. Radioloģija 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, un Leboeuf-Eed, K. Modiskās izmaiņas un to saistība ar klīniskajiem atklājumiem. European Spine Journal: Eiropas Mugurkaula biedrības, Eiropas Mugurkaula deformācijas biedrības un Eiropas Kakla daļas mugurkaula pētniecības biedrības oficiālais izdevums 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Modiskas izmaiņas jostas skriemeļu gala plāksnēs: izplatība un saistība ar muguras lejasdaļas sāpēm un išiasu pusmūža vīriešu kārtas strādniekiem. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. un Dalinka, M. Kaulu smadzeņu izmaiņu MRI, kas redzamas gala plāksnes tuvumā jostas daļas deģeneratīvas slimības gadījumā. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ un Carter, JR Deģeneratīva disku slimība: mugurkaulāja smadzeņu izmaiņu novērtēšana ar MRI. Radioloģija 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS un Carter, JR. Deģeneratīvas disku slimības attēlveidošana. Radioloģija 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Neovertebrālās gala plāksnes (Modic) signāla izmaiņu prognozētāji vispārējā populācijā. European Spine Journal: Eiropas Mugurkaula biedrības, Eiropas Mugurkaula deformācijas biedrības un Eiropas Kakla mugurkaula pētniecības biedrības oficiālā publikācija, 19. nodaļa, 129.–135. lpp., doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Alberts, HB un Mannišs, K. Modiskās izmaiņas pēc jostas diska trūces. European Spine Journal: Eiropas Mugurkaula biedrības, Eiropas Mugurkaula deformācijas biedrības un Eiropas Kakla daļas mugurkaula pētniecības biedrības oficiālā publikācija 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. un Kaapa, E. Modiskās I tipa izmaiņas var paredzēt strauji progresējošu deformējošu disku deģenerāciju: 1 gada prospektīvs pētījums. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ un Fan, SW. Modiskās izmaiņas: iespējamie cēloņi un ietekme uz jostas diska deģenerāciju. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Iekšējā diska plīsums. Diska noslīdēšanas problēmas 50 gadu laikā. Mugurkauls (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Publicēšanas laiks: 2024. gada 13. decembris