Paldies, ka apmeklējāt Nature.com. Pārlūka versijai, kuru izmantojat, ir ierobežots CSS atbalsts. Lai iegūtu labākos rezultātus, mēs iesakām izmantot jaunāku pārlūku (vai saderības režīma atspējošanu Internet Explorer). Pa to laiku, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs parādīsim vietni bez stiliem un Javascript.
Modisko pārmaiņu (MC) dzīvnieku modeļu izveidošana ir svarīgs pamats MC izpētei. Piecdesmit četri Jaunzēlandes baltie truši tika sadalīti fiktīvās operācijas grupā, muskuļu implantācijas grupā (ME grupā) un kodola pulposus implantācijas grupā (NPE Group). NPE grupā starpskriemeļu disks tika atklāts ar anterolaterālu jostas ķirurģisku pieeju, un adata tika izmantota, lai caurdurtu L5 mugurkaula korpusu netālu no gala plāksnes. NP no L1/2 starpskriemeļu diska ekstrahēja ar šļirci un tajā ievadīts. Urbjot caurumu apakšhondrālā kaulā. Ķirurģiskās procedūras un urbšanas metodes muskuļu implantācijas grupā un fiktīvo operāciju grupā bija tādas pašas kā NP implantācijas grupā. ME grupā caurumā tika ievietots muskuļa gabals, savukārt fiktīvā operācijas grupā nekas netika ievietots caurumā. Pēc operācijas tika veikta MRI skenēšana un molekulārā bioloģiskā pārbaude. Signāls NPE grupā mainījās, taču fiktīvo operāciju grupā un ME grupā nebija acīmredzamu signāla maiņu. Histoloģiskais novērojums parādīja, ka implantācijas vietā tika novērota patoloģiska audu proliferācija, un NPE grupā tika palielināta IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija. NP implantācija subhondrālā kaulā var veidot MC dzīvnieku modeli.
Modiskās izmaiņas (MC) ir skriemeļu gala plāksnes un blakus esošo kaulu smadzeņu bojājumi, kas redzami magnētiskās rezonanses attēlveidošanā (MRI). Tie ir diezgan izplatīti indivīdiem ar saistītiem simptomiem1. Daudzi pētījumi ir uzsvēruši MC nozīmi sakarā ar tā saistību ar sāpēm ar zemu muguras (LBP) 2,3. De Roos et al.4 un Modic et al.5 Neatkarīgi vispirms aprakstīja trīs dažādus subhondrāla signāla anomālijas mugurkaula kaulu smadzenēs. I tipa izmaiņas ir hipointensīvas T1 svērtās (T1W) sekvencēs un hiperintense uz T2 svērtām (T2W) sekvencēm. Šis bojājums atklāj plaisas gala plāksnes un blakus esošos asinsvadu granulācijas audus kaulu smadzenēs. Modiskās II tipa izmaiņas parāda augstu signālu gan T1W, gan T2W sekvencēs. Šāda veida bojājumos var atrast gala plāksnes iznīcināšanu, kā arī blakus esošo kaulu smadzeņu histoloģisko tauku nomaiņu. Modiskās III tipa izmaiņas parāda zemu signālu T1W un T2W sekvencēs. Novēroti sklerotiski bojājumi, kas atbilst gala plāksnēm6. MC tiek uzskatīts par mugurkaula patoloģisku slimību un ir cieši saistīts ar daudzām mugurkaula 7,9,9 deģeneratīvām slimībām.
Ņemot vērā pieejamos datus, vairāki pētījumi ir snieguši detalizētu ieskatu MC etioloģijā un patoloģiskajos mehānismos. Alberts et al. ierosināja, ka MC var izraisīt disku trūce8. Hu et al. attiecināja MC ar smagu disku deģenerāciju10. Kroc ierosināja jēdzienu “iekšējā diska plīsums”, kurā teikts, ka atkārtotas diska traumas var izraisīt mikroteārus gala plāksnei. Pēc spraugas veidošanās kodola pulposus (NP) beigu plāksnes iznīcināšana var izraisīt autoimūnu reakciju, kas vēl vairāk noved pie MC11 attīstības. Ma et al. dalījās ar līdzīgu viedokli un ziņoja, ka NP izraisītajai autoimunitātei ir galvenā loma MC12 patoģenēzē.
Imūnsistēmas šūnām, īpaši CD4+ T palīga limfocītiem, ir kritiska loma autoimunitātes patoģenēzē13. Nesen atklātā Th17 apakšgrupa rada proinflammatīvo citokīnu IL-17, veicina ķemokīna ekspresiju un stimulē T šūnas bojātos orgānos, lai iegūtu IFN-γ14. Th2 šūnām ir arī unikāla loma imūno reakciju patoģenēzē. IL-4 ekspresija kā reprezentatīva Th2 šūna var izraisīt smagas imūnopatoloģiskas sekas15.
Lai arī ir veikti daudzi klīniskie pētījumi par MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, joprojām trūkst piemērotu eksperimentālu modeļu, kas var atdarināt MC procesu, kas bieži notiek cilvēkiem un var būt Izmanto, lai izpētītu etioloģiju vai jaunu ārstēšanu, piemēram, mērķtiecīgu terapiju. Līdz šim ir ziņots tikai par dažiem MC dzīvnieku modeļiem, kas izpētītu pamatā esošos patoloģiskos mehānismus.
Balstoties uz Alberta un MA ierosināto autoimūnu teoriju, šis pētījums izveidoja vienkāršu un reproducējamu trušu MC modeli, autotransplantējot NP netālu no urbtās mugurkaula gala plāksnes. Citi mērķi ir ievērot dzīvnieku modeļu histoloģiskās īpašības un novērtēt NP specifiskos mehānismus MC attīstībā. Šajā nolūkā mēs izmantojam tādas metodes kā molekulārā bioloģija, MRI un histoloģiskie pētījumi, lai izpētītu MC progresēšanu.
Divi truši nomira no asiņošanas operācijas laikā, un MRI anestēzijas laikā nomira četri truši. Atlikušie 48 truši izdzīvoja un pēc operācijas neuzrādīja uzvedības vai neiroloģiskas pazīmes.
MRI parāda, ka iegulto audu signāla intensitāte dažādos caurumos ir atšķirīga. L5 skriemeļa ķermeņa signāla intensitāte NPE grupā pakāpeniski mainījās 12, 16 un 20 nedēļas pēc ievietošanas (T1W secība parādīja zemu signālu, un T2W secība parādīja jauktu signālu plus zemu signālu) (1. attēls C), bet MRI parādīšanās no pārējām divām iegulto detaļu grupām tajā pašā laika posmā palika salīdzinoši stabila (1.A, B att.).
(A) Truša jostas mugurkaula reprezentatīvs secīgs MRI 3 laika punktos. Signāla anomālijas netika atrastas fiktīvās operācijas grupas attēlos. (B) ME grupā mugurkaula ķermeņa signāla raksturlielumi ir līdzīgi tam, kas ir fiktīvo operācijas grupā, un laika gaitā iegulšanas vietā iegulšanas vietā netiek novērotas būtiskas signāla izmaiņas. C) NPE grupā zemais signāls ir skaidri redzams T1W secībā, un jauktais signāls un zemais signāls ir skaidri redzams T2W secībā. Sākot no 12 nedēļu perioda līdz 20 nedēļu periodam, sporādiski augstie signāli, kas apņem zemos signālus T2W secībā.
Acīmredzamu kaulu hiperplāziju var redzēt mugurkaulnieka ķermeņa implantācijas vietā NPE grupā, un kaulu hiperplāzija notiek ātrāk no 12 līdz 20 nedēļām (2. attēls C), salīdzinot ar NPE grupu, modelētajā mugurkaula mugurkaulā būtiskas izmaiņas netiek novērotas, būtiskas izmaiņas netiek novērotas nekādas būtiskas izmaiņas mugurkaulā. ķermeņi; Sham Group un Me grupa (2.C attēls) 2A, B).
(A) Skriemeļa ķermeņa virsma pie implantētās daļas ir ļoti gluda, caurums labi dziedē, un skriemeļa ķermenī nav hiperplāzijas. B) Implantētās vietas forma ME grupā ir līdzīga tai, kas ir fiktīvā operācijas grupā, un laika gaitā implantētās vietas izskatā nav acīmredzamas izmaiņas. C) Kaulu hiperplāzija notika implantētajā vietā NPE grupā. Kaulu hiperplāzija strauji palielinājās un pat stiepās caur starpskriemeļu disku līdz kontralaterālajam skriemeļa ķermenim.
Histoloģiskā analīze sniedz sīkāku informāciju par kaulu veidošanos. 3. attēlā parādītas pēcoperācijas sekciju fotogrāfijas, kas iekrāsotas ar H&E. Samierinātības grupā hondrocīti bija labi sakārtoti un šūnu proliferācija netika atklāta (3.A attēls). Situācija ME grupā bija līdzīga fiktīvo operāciju grupā (3.B attēls). Tomēr NPE grupā implantācijas vietā tika novērots liels skaits hondrocītu un NP līdzīgu šūnu proliferācija (3.c attēls);
A) Trabekulas var redzēt netālu no gala plāksnes, hondrocīti ir kārtīgi izkārtoti ar vienotu šūnu izmēru un formu un bez proliferācijas (40 reizes). (B) Implantācijas vietas stāvoklis ME grupā ir līdzīgs SHAM grupai. Var redzēt trabekulas un hondrocītus, taču implantācijas vietā nav acīmredzamas izplatības (40 reizes). (B) Var redzēt, ka hondrocīti un NP līdzīgās šūnas ievērojami proliferējas, un hondrocītu forma un lielums ir nevienmērīgs (40 reizes).
Interleikīna 4 (IL-4) mRNS, interleikīna 17 (IL-17) mRNS un interferons γ (IFN-γ) mRNS ekspresija tika novērota gan NPE, gan ME grupās. Salīdzinot mērķa gēnu ekspresijas līmeņus, NPE grupā tika ievērojami palielināti IL-4, IL-17 un IFN-γ gēnu ekspresijas, salīdzinot ar ME grupas un SHAM operācijas grupu (4. att.) (P <0,05). Salīdzinot ar fiktīvo operācijas grupu, IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresijas līmeņi ME grupā tikai nedaudz palielinājās un nesasniedza statistiskas izmaiņas (P> 0,05).
IL-4, IL-17 un IFN-γ mRNS ekspresija NPE grupā uzrādīja ievērojami augstāku tendenci nekā fiktīvās operācijas grupā un ME grupā (P <0,05).
Turpretī ekspresijas līmeņi ME grupā neuzrādīja būtiskas atšķirības (P> 0,05).
Western blot analīze tika veikta, izmantojot komerciāli pieejamas antivielas pret IL-4 un IL-17, lai apstiprinātu mainīto mRNS ekspresijas modeli. Kā parādīts 5.a, B attēlā, salīdzinot ar ME grupu un fiktīvo operācijas grupu, IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis NPE grupā tika ievērojami palielināts (P <0,05). Salīdzinot ar fiktīvo operācijas grupu, IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis ME grupā arī nespēja sasniegt statistiski nozīmīgas izmaiņas (P> 0,05).
(A) IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis NPE grupā bija ievērojami augstāks nekā ME grupā un placebo grupā (P <0,05). B) Western blot histogramma.
Sakarā ar ierobežoto cilvēku paraugu skaitu, kas iegūti operācijas laikā, ir nedaudz grūti skaidri un detalizēti pētījumi par MC patoģenēzi. Mēs mēģinājām izveidot MC dzīvnieku modeli, lai izpētītu tā iespējamos patoloģiskos mehānismus. Tajā pašā laikā tika izmantots radioloģiskais novērtējums, histoloģiskais novērtējums un molekulārais bioloģiskais novērtējums, lai sekotu MC kursam, ko izraisa NP autografs. Tā rezultātā NP implantācijas modelis izraisīja pakāpeniskas signāla intensitātes izmaiņas no 12 nedēļu līdz 20 nedēļu laika punktiem (jaukts zems signāls T1W sekvencēs un zems signāls T2W sekvencēs), norādot uz audu izmaiņām, kā arī histoloģisko un molekulāro Bioloģiskie novērtējumi apstiprināja radioloģiskā pētījuma rezultātus.
Šī eksperimenta rezultāti parāda, ka redzes un histoloģiskās izmaiņas notika mugurkaula ķermeņa pārkāpuma vietā NPE grupā. Tajā pašā laikā tika novērota IL-4, IL-17 un IFN-γ gēnu, kā arī IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija, kas norāda, ka autologa kodola pulposus audu pārkāpums mugurkaulā mugurkaula pārkāpums ir ieslēgts. Ķermenis var izraisīt virkni signālu un morfoloģiskas izmaiņas. Ir viegli atrast, ka dzīvnieka modeļa skriemeļu ķermeņu signāla raksturlielumi (zems signāls T1W secībā, jaukts signāls un zems signāls T2W secībā) ir ļoti līdzīgi kā cilvēka skriemeļu šūnu īpašībām, kā arī MRI raksturlielumi Apstipriniet histoloģijas un bruto anatomijas novērojumus, tas ir, izmaiņas mugurkaula ķermeņa šūnās ir progresējošas. Lai arī akūtas traumas izraisītā iekaisuma reakcija var parādīties drīz pēc punkcijas, MRI rezultāti parādīja, ka pakāpeniski pieaugošās signāla izmaiņas parādījās 12 nedēļas pēc punkcijas un saglabājās līdz 20 nedēļām bez jebkādām atveseļošanās pazīmēm vai MRI izmaiņu maiņas. Šie rezultāti liecina, ka autologais skriemeļu NP ir uzticama metode progresīva MV izveidošanai trušiem.
Šim punkcijas modelim ir vajadzīgas atbilstošas prasmes, laiks un ķirurģiskas pūles. Sākotnējos eksperimentos paravertebrālo saišu struktūru sadalīšana vai pārmērīga stimulēšana var izraisīt skriemeļu osteofītu veidošanos. Jāuzmanās, lai nesabojātu un kairinātu blakus esošos diskus. Tā kā iespiešanās dziļums ir jākontrolē, lai iegūtu konsekventus un reproducējamus rezultātus, mēs manuāli izveidojām spraudni, nogriežot 3 mm garas adatas apvalku. Šī spraudņa izmantošana nodrošina vienmērīgu urbšanas dziļumu skriemeļa korpusā. Sākotnējos eksperimentos operācijā iesaistītie trīs ortopēdiskie ķirurgi atrada 16 gabarītu adatas, kuras ir vieglāk strādāt, nekā 18 gabarītu adatas vai citas metodes. Lai urbšanas laikā izvairītos no pārmērīgas asiņošanas, adatas turēšana uz brīdi kādu laiku nodrošinās piemērotāku ievietošanas caurumu, kas liek domāt, ka šādā veidā var kontrolēt noteiktu MC pakāpi.
Lai arī daudzi pētījumi ir vērsti uz MC, maz ir zināms par MC25,26,27 etioloģiju un patoģenēzi. Balstoties uz mūsu iepriekšējiem pētījumiem, mēs atklājām, ka autoimunitātei ir galvenā loma MC12 rašanās un attīstībā. Šajā pētījumā tika pārbaudīta IL-4, IL-17 un IFN-γ kvantitatīvā ekspresija, kas ir galvenie CD4+ šūnu diferenciācijas ceļi pēc antigēna stimulācijas. Mūsu pētījumā, salīdzinot ar negatīvo grupu, NPE grupai bija augstāka IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija, kā arī IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis bija augstāks.
Klīniski IL-17 mRNS ekspresija tiek palielināta NP šūnās no pacientiem ar disku trūci28. Paaugstināti IL-4 un IFN-γ ekspresijas līmeņi tika atrasti arī akūtā, kas nav kompresijas diska trūces modelī, salīdzinot ar veselīgu kontroli29. IL-17 ir galvenā loma iekaisumā, audu ievainojumos autoimūnās slimībās30 un pastiprina imūno reakciju uz IFN-γ31. Paaugstināts IL-17 mediētais audu traumas ziņojums ir ziņots par MRL/LPR MICE32 un autoimunitāti jutīgām pelēm33. IL-4 var kavēt proinflammatīvo citokīnu (piemēram, IL-1β un TNFα) un makrofāgu aktivizācijas34 ekspresiju34. Tika ziņots, ka IL-4 mRNS ekspresija NPE grupā bija atšķirīga, salīdzinot ar IL-17 un IFN-γ vienlaikus; IFN-γ mRNS ekspresija NPE grupā bija ievērojami augstāka nekā citās grupās. Tāpēc IFN-γ ražošana var būt starpnieks iekaisuma reakcijā, ko izraisa NP starpkalācija. Pētījumi parādīja, ka IFN-γ ražo vairāki šūnu tipi, ieskaitot aktivizētās 1. tipa palīgu T šūnas, dabiskās slepkavas šūnas un makrofāgi35,36, un tas ir galvenais pretiekaisuma citokīns, kas veicina imūno reakciju37.
Šis pētījums liecina, ka autoimūna reakcija var būt iesaistīta MC rašanās un attīstībā. Luoma et al. atklāja, ka MC un ievērojamā NP signāla raksturlielumi ir līdzīgi MRI, un abi t2W secībā38 uzrāda augstu signālu. Ir apstiprināts, ka daži citokīni ir cieši saistīti ar MC parādīšanos, piemēram, IL-139. Ma et al. ierosināja, ka NP augšup vai lejupejošajam izvirzījumam var būt liela ietekme uz MC12 rašanos un attīstību. Bobechko40 un Herzbein et al.41 ziņoja, ka NP ir imūntoleranti audi, kas nevar iekļūt asinsvadu cirkulācijā no dzimšanas. NP izvirzījumi ievieš svešķermeņus asins piegādi, tādējādi starpniecībā starp vietējām autoimūnām reakcijām42. Autoimūnas reakcijas var izraisīt lielu skaitu imūno faktoru, un, ja šie faktori tiek nepārtraukti pakļauti audiem, tie var izraisīt signālas izmaiņas43. Šajā pētījumā IL-4, IL-17 un IFN-γ pārmērīga ekspresija ir tipiski imūnie faktori, vēl vairāk pierādot ciešo saistību starp NP un MCS44. Šis dzīvnieku modelis labi atdarina NP izrāvienu un iekļūšanu gala plāksnē. Šis process vēl vairāk atklāja autoimunitātes ietekmi uz MC.
Kā gaidīts, šis dzīvnieku modelis nodrošina mums iespējamu platformu MC izpētei. Tomēr šim modelim joprojām ir daži ierobežojumi: pirmkārt, dzīvnieku novērošanas fāzē histoloģiskās un molekulārās bioloģijas pārbaudes ir jāatstāj daži starpposma truši, tāpēc daži dzīvnieki laika gaitā “neizmanto”. Otrkārt, kaut arī šajā pētījumā ir noteikti trīs laika punkti, diemžēl mēs modelējām tikai viena veida MC (Modiskā I tipa maiņa), tāpēc ar to nepietiek, lai pārstāvētu cilvēku slimības attīstības procesu, un vairāk laika punktu ir jāiestata Labāk ievērojiet visas signāla izmaiņas. Treškārt, audu struktūras izmaiņas patiešām var skaidri parādīt histoloģiskā krāsošana, taču dažas specializētas metodes var labāk atklāt mikrostrukturālās izmaiņas šajā modelī. Piemēram, fibrocartilage veidošanās trušu starpskrītru diskos45 tika izmantota polarizēta gaismas mikroskopija. NP ilgtermiņa ietekme uz MC un gala plāksni prasa turpmāku izpēti.
Piecdesmit četri Jaunzēlandes vīrieši baltie truši (svars apmēram 2,5–3 kg, vecums 3–3,5 mēneši) tika nejauši sadalīti fiktīvās operācijas grupā, muskuļu implantācijas grupā (ME grupā) un nervu sakņu implantācijas grupā (NPE Group). Visas eksperimentālās procedūras apstiprināja Tjandzjina slimnīcas ētikas komiteja, un eksperimentālās metodes tika veiktas stingri saskaņā ar apstiprinātajām vadlīnijām.
Ir veikti daži uzlabojumi S. sobajima 46 ķirurģiskajā paņēmienā. Katrs trusis tika novietots sānu atkausēšanas stāvoklī, un piecu secīgu jostas starpskriemeļu disku (IVD) priekšējā virsma tika atklāta, izmantojot posterolateral retroperitoneālo pieeju. Katram trusim tika dota vispārēja anestēzija (20% uretāna, 5 ml/kg caur ausu vēnu). No ribu apakšējās malas līdz iegurņa malai, 2 cm ventrālā uz paravertebrālajiem muskuļiem tika veikts garenisks ādas griezums. Labo anterolaterālo mugurkaulu no L1 līdz L6 tika pakļauts asai un neasai virsējo zemādas audu, retroperitoneālo audu un muskuļu sadalīšanai (6.A attēls). Diska līmenis tika noteikts, izmantojot iegurņa malu kā anatomisku L5-L6 diska līmeņa orientāru. Izmantojiet 16 gabarīta punkcijas adatu, lai urbtu caurumu netālu no L5 skriemeļa gala plāksnes līdz 3 mm dziļumam (6.B attēls). Izmantojiet 5 ml šļirci, lai aspirētu autologu kodola pulposu L1-L2 starpskriemeļu diskā (6.C attēls). Noņemiet kodola pulposus vai muskuļus atbilstoši katras grupas prasībām. Pēc urbuma cauruma padziļināšanas uz dziļo fasciju, virspusējo fasādi un ādu novieto absorbējamas šuves, rūpējoties, lai operācijas laikā nesabojātu skriemeļa ķermeņa periosteālos audus.
A) L5 - L6 disks tiek pakļauts, izmantojot posterolaterālu retroperitoneālo pieeju. (B) Izmantojiet 16 izmēra adatu, lai urbtu caurumu netālu no L5 gala plāksnes. C) Autologu MF tiek novākts.
Vispārējā anestēzija tika ievadīta ar 20% uretāna (5 ml/kg), ko ievadīja caur ausu vēnu, un mugurkaula jostas rentgenogrāfus atkārtoja 12, 16 un 20 nedēļas pēcoperācijas laikā.
Truši tika upurēti ar intramuskulāru ketamīna (25,0 mg/kg) injekciju un intravenozu nātrija pentobarbitālu (1,2 g/kg) 12, 16 un 20 nedēļas pēc operācijas. Visa mugurkaula tika noņemta histoloģiskai analīzei un tika veikta reāla analīze. Lai noteiktu imūno faktoru izmaiņas, tika izmantota kvantitatīvā reversā transkripcija (RT-QPCR) un Western blotēšana.
MRI izmeklējumi tika veikti trušiem, izmantojot 3,0 T klīnisko magnētu (GE Medical Systems, Florence, SC), kas aprīkots ar ortogonālo ekstremitāšu spoles uztvērēju. Truši tika anestēzēti ar 20% uretāna (5 ml/kg) caur ausu vēnu un pēc tam magnētā ievietoja guļus ar jostas reģionu, kura centrā ir 5 collu diametra apļveida virsmas spole (GE medicīnas sistēmas). Lai definētu jostas diska atrašanās vietu no L3-L4 līdz L5-L6, tika iegūti koronāli T2 svērtie lokalizatora attēli (TR, 1445 ms; TE, 37 ms). Sagitālā plaknes T2 svērtās šķēles tika iegūtas ar šādiem iestatījumiem: ātra spin-e-atsākšanas secība ar atkārtojuma laiku (TR) 2200 ms un atbalss laiku (TE) 70 ms, matrica; Vizuālais lauks ar 260 un astoņiem stimuliem; Griešanas biezums bija 2 mm, sprauga bija 0,2 mm.
Pēc pēdējās fotogrāfijas uzņemšanas un pēdējais trusis tika nogalināts, fiktīvais, muskuļa iespiests un NP diski tika noņemti histoloģiskai pārbaudei. Audi 1 nedēļu tika fiksēti 10% neitrālā buferētā formalīnā, atkaļķoti ar etilēndiamīnetetraetiķskābi un parafīnu sadalītu. Audu bloki tika iestrādāti parafīnā un sagriezti sagitālajās sekcijās (5 μm biezi), izmantojot mikrotomu. Sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E).
Pēc starpskriemeļu disku savākšanas no trušiem katrā grupā, kopējais RNS tika iegūts, izmantojot UNIQ-10 kolonnu (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Ķīna) saskaņā ar ražotāja instrukcijām un Emprom II reversās transkripcijas sistēmu (Promega Inc. , Madisons, WI, ASV). Tika veikta reversā transkripcija.
RT-qPCR tika veikts, izmantojot PRISM 7300 (Applied Biosystems Inc., ASV) un Sybr Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) saskaņā ar ražotāja instrukcijām. PCR reakcijas tilpums bija 20 μl, un tajā bija 1,5 μL atšķaidīta cDNS un 0,2 μm katra grunts. Primerus projektēja Oligoperfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA), un tos ražoja Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Ķīna) (1. tabula). Tika izmantoti šādi termiskās ciklošanas apstākļi: sākotnējā polimerāzes aktivizācijas solis 94 ° C temperatūrā 2 minūtes, pēc tam 40 cikli 15 sekundes katrā 94 ° C temperatūrā veidnes denaturēšanai, atkvēlināšana 1 minūti 60 ° C temperatūrā, pagarinājumu un fluorescenci. Mērījumi tika veikti 1 minūtē 72 ° C temperatūrā. Visi paraugi tika pastiprināti trīs reizes, un vidējā vērtība tika izmantota RT-QPCR analīzei. Amplifikācijas dati tika analizēti, izmantojot FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ASV). IL-4, IL-17 un IFN-γ gēna ekspresija tika normalizēti līdz endogēnai kontrolei (ACTB). Mērķa mRNS relatīvie ekspresijas līmeņi tika aprēķināti, izmantojot 2-ΔΔCT metodi.
Kopējais olbaltumvielu daudzums tika ekstrahēts no audiem, izmantojot audu homogenizatoru RIPA līzes buferšķīdumā (kas satur proteāzi un fosfatāzes inhibitora kokteili), un pēc tam centrifugēja ar ātrumu 13 000 apgr./min 20 minūtes 4 ° C temperatūrā, lai noņemtu audu atliekas. Piecdesmit mikrogrami olbaltumvielu tika ielādēti vienā joslā, atdalīti ar 10% SDS-PAGE un pēc tam pārnesa uz PVDF membrānu. Bloķēšana tika veikta ar 5% beztauku sausu pienu Tris buferšķīdumā (TBS), kas satur 0,1% Tween 20 1 stundu istabas temperatūrā. Membrāna tika inkubēta ar trušu anti-dekorīna primāro antivielu (atšķaidīta 1: 200; Boster, Wuhan, Ķīna) (atšķaidīta 1: 200; Bioss, Pekina, Ķīna) uz nakti 4 ° C temperatūrā un reaģēja otrajās dienās; Ar sekundāro antivielu (kazu anti-trušu imūnglobulīns G pie 1: 40 000 atšķaidīšanas) apvienojumā ar mārrutku peroksidāzi (Boster, Wuhan, Ķīna) 1 stundu istabas temperatūrā. Western blot signāli tika noteikti, palielinoties ķimiluminiscējošajai membrānai pēc rentgenstaru apstarošanas. Densitometriskai analīzei bloti tika skenēti un kvantitatīvi noteikti, izmantojot joslu skaņu programmatūru, un rezultāti tika izteikti kā mērķa gēna imūnreaktivitātes attiecība pret tubulīna imūnreaktivitāti.
Statistiskie aprēķini tika veikti, izmantojot SPSS16.0 programmatūras paketi (SPSS, ASV). Pētījuma laikā savāktie dati tika izteikti kā vidējā ± standartnovirze (vidējā ± SD) un analizētas, izmantojot vienvirziena atkārtotu dispersijas analīzi (ANOVA), lai noteiktu atšķirības starp abām grupām. P <0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.
Tādējādi MC dzīvnieku modeļa izveidošana, implantējot autologus NPS mugurkaula ķermenī un veicot makroanatomisku novērojumu, MRI analīze, histoloģiskā novērtēšana un molekulārā bioloģiskā analīze var kļūt par svarīgu instrumentu cilvēka MC mehānismu novērtēšanai un izpratnei un jaunas terapeitiskās terapijas izstrādes izstrādei novērtēšanai un izpratnei. iejaukšanās.
Kā citēt šo rakstu: Han, C. et al. Dzīvnieku modelis ar modiskām izmaiņām tika izveidots, implantējot autologu kodola pulposu mugurkaula jostas daļas subhondrālajā kaulā. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. un Boos, N. Magnētiskās mugurkaula magnētiskās rezonanses attēlveidošana: disku trūces un aiztures izplatība, nervu sakņu saspiešana, gala plāksnes patoloģijas un aspekta locītavas osteoartrīts asimptomātiskos brīvprātīgos Apvidū likme. Radioloģija 209, 661–666, doi: 10.1148/radioloģija.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS un Leboeuf-Eed, K. Modiskas izmaiņas un to saistība ar klīniskajiem atklājumiem. Eiropas mugurkaula žurnāls: Eiropas Mugurkaula biedrības oficiālā publikācija, Eiropas mugurkaula kroplības biedrība un Eiropas Dzemdes kakla mugurkaula pētījumu biedrība 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Modiskas izmaiņas jostas skriemeļu gala plāksnēs: izplatība un asociācija ar sāpēm muguras lejasdaļā un išiass pusmūža vīriešu strādniekiem. Mugurkauls 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.br.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. un Dalinka, M. Kaulu smadzeņu MRI mainās netālu no gala plāksnes mugurkaula jostas daļas deģeneratīvas slimības. Ajr. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modika, MT, Šteinberga, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ un Carter, Jr Deģeneratīvā diska slimība: mugurkaula smadzeņu izmaiņu novērtēšana ar MRI. Radioloģija 166, 193–199, doi: 10.1148/radioloģija.166.1.3336678 (1988).
Modika, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS un Carter, JR deģeneratīvas diska slimības attēlveidošana. Radioloģija 168, 177–186, doi: 10.1148/radioloģija.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Nevertebrālās gala plāksnes (MODIC) signāla izmaiņas vispārējā populācijā. Eiropas mugurkaula žurnāls: Eiropas Mugurkaula biedrības oficiālā publikācija, Eiropas mugurkaula kroplības biedrība un Eiropas Dzemdes kakla mugurkaula pētījumu biedrība, 19. nodaļa, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Alberts, HB un Mannisch, K. Modiskas izmaiņas pēc jostas diska trūces. Eiropas mugurkaula žurnāls: Eiropas Mugurkaula biedrības oficiālā publikācija, Eiropas mugurkaula kroplības biedrība un Eiropas Dzemdes kakla mugurkaula pētījumu biedrība 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. un Kaapa, E. Modiskās I tipa izmaiņas var paredzēt strauji progresējošu deformācijas disku deģenerāciju: 1 gada perspektīvs pētījums. Eiropas mugurkaula žurnāls 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ un Fan, SW Modiskās izmaiņas: iespējamie cēloņi un ieguldījums jostas diska deģenerācijā. Medicīniskās hipotēzes 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV iekšējais disks plīsums. Disku prolapss problēmas 50 gadu laikā. Mugurkauls (Phila PA 1976) 11, 650–653 (1986).
Pasta laiks: decembris-13-2024