Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai iegūtu vislabākos rezultātus, ieteicams izmantot jaunāku pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs parādīsim vietni bez stiliem un JavaScript.
Modic pārmaiņu (MC) dzīvnieku modeļu izveide ir svarīgs pamats MC izpētei. Piecdesmit četri Jaunzēlandes baltie truši tika sadalīti fiktīvu operāciju grupā, muskuļu implantācijas grupā (ME grupa) un kodola pulposa implantācijas grupā (NPE grupa). NPE grupā starpskriemeļu disks tika atklāts ar anterolaterālo jostas ķirurģisko pieeju, un adata tika izmantota, lai caurdurtu L5 mugurkaula ķermeni pie gala plāksnes. NP tika ekstrahēts no L1/2 starpskriemeļu diska ar šļirci un ievadīts tajā. Cauruma urbšana subhondrālajā kaulā. Ķirurģiskās procedūras un urbšanas metodes muskuļu implantācijas grupā un fiktīvas operācijas grupā bija tādas pašas kā NP implantācijas grupā. ME grupā caurumā tika ievietots muskuļa gabals, savukārt fiktīvo operāciju grupā bedrē nekas netika ievietots. Pēc operācijas tika veikta MRI skenēšana un molekulāri bioloģiskā pārbaude. Signāls NPE grupā mainījās, bet fiktīvas operācijas grupā un ME grupā nebija acīmredzamu signāla izmaiņu. Histoloģiskie novērojumi parādīja, ka implantācijas vietā tika novērota patoloģiska audu proliferācija, un NPE grupā palielinājās IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija. NP implantācija subhondrālajā kaulā var veidot MC dzīvnieku modeli.
Modiskās izmaiņas (MC) ir mugurkaula gala plākšņu un blakus esošo kaulu smadzeņu bojājumi, kas redzami magnētiskās rezonanses attēlveidošanā (MRI). Tās ir diezgan izplatītas personām ar saistītiem simptomiem1. Daudzos pētījumos ir uzsvērta MC nozīme, jo tā ir saistīta ar muguras sāpēm (LBP)2,3. de Roos et al.4 un Modic et al.5 neatkarīgi vispirms aprakstīja trīs dažādus subhondrālo signālu anomāliju veidus mugurkaula kaulu smadzenēs. Modic I tipa izmaiņas ir hipointensīvas T1 svērtajās (T1W) sekvencēs un hiperintensīvas T2 svērtajās (T2W) sekvencēs. Šis bojājums atklāj plaisu gala plāksnes un blakus esošos asinsvadu granulācijas audus kaulu smadzenēs. Modic tipa II izmaiņas parāda augstu signālu gan T1W, gan T2W sekvencēs. Šāda veida bojājumos var konstatēt gala plāksnes iznīcināšanu, kā arī blakus esošo kaulu smadzeņu histoloģisku tauku nomaiņu. Modic tipa III izmaiņas parāda zemu signālu T1W un T2W secībās. Ir novēroti sklerotiski bojājumi, kas atbilst gala plāksnēm6. MC tiek uzskatīta par mugurkaula patoloģisku slimību un ir cieši saistīta ar daudzām deģeneratīvām mugurkaula slimībām7,8,9.
Ņemot vērā pieejamos datus, vairāki pētījumi ir snieguši detalizētu ieskatu MC etioloģijā un patoloģiskajos mehānismos. Alberts u.c. ierosināja, ka MC var izraisīt diska trūce8. Hu et al. attiecināja MC uz smagu diska deģenerāciju10. Kroks ierosināja "iekšējā diska plīsuma" jēdzienu, kurā teikts, ka atkārtota diska trauma var izraisīt mikroplīsumus gala plāksnē. Pēc plaisas veidošanās gala plāksnes iznīcināšana, ko veic kodols pulposus (NP), var izraisīt autoimūnu reakciju, kas vēl vairāk noved pie MC11 attīstības. Ma et al. bija līdzīgs viedoklis un ziņoja, ka NP izraisītajai autoimunitātei ir galvenā loma MC12 patoģenēzē.
Imūnās sistēmas šūnām, īpaši CD4+ T palīglimfocītiem, ir izšķiroša loma autoimunitātes patoģenēzē13. Nesen atklātā Th17 apakškopa ražo proinflammatorisku citokīnu IL-17, veicina ķīmokīnu ekspresiju un stimulē T šūnas bojātos orgānos, lai ražotu IFN-γ14. Th2 šūnām ir arī unikāla loma imūnreakciju patoģenēzē. IL-4 kā reprezentatīvas Th2 šūnas ekspresija var izraisīt smagas imūnpatoloģiskas sekas15.
Lai gan ir veikti daudzi klīniskie pētījumi par MC16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, joprojām trūkst piemērotu eksperimentālo modeļu ar dzīvniekiem, kas varētu atdarināt MC procesu, kas bieži notiek cilvēkiem un var būt izmanto, lai izpētītu etioloģiju vai jaunas ārstēšanas metodes, piemēram, mērķterapija. Līdz šim ir ziņots, ka tikai daži MC dzīvnieku modeļi pētīja pamatā esošos patoloģiskos mehānismus.
Pamatojoties uz Alberta un Ma ierosināto autoimūno teoriju, šajā pētījumā tika izveidots vienkāršs un reproducējams truša MC modelis, autotransplantējot NP netālu no urbtās skriemeļa gala plāksnes. Citi mērķi ir novērot dzīvnieku modeļu histoloģiskās īpašības un novērtēt specifiskos NP mehānismus MC attīstībā. Šim nolūkam mēs izmantojam tādas metodes kā molekulārā bioloģija, MRI un histoloģiskie pētījumi, lai pētītu MC progresēšanu.
Divi truši nomira no asiņošanas operācijas laikā, un četri truši nomira anestēzijas laikā MRI laikā. Atlikušie 48 truši izdzīvoja un pēc operācijas neuzrādīja nekādas uzvedības vai neiroloģiskas pazīmes.
MRI parāda, ka iegulto audu signāla intensitāte dažādos caurumos ir atšķirīga. L5 mugurkaula ķermeņa signāla intensitāte NPE grupā pakāpeniski mainījās 12., 16. un 20. nedēļā pēc ievietošanas (T1W secībā bija zems signāls, un T2W secībā bija jaukts signāls plus zems signāls) (1.C att.), savukārt MRI parādījās. no pārējām divām iegulto daļu grupām tajā pašā periodā saglabājās relatīvi stabilas (1.A, B att.).
(A) Reprezentatīvi secīgi truša mugurkaula jostas daļas MRI 3 laika punktos. Fiktīvas operācijas grupas attēlos signāla novirzes netika konstatētas. (B) mugurkaula ķermeņa signāla raksturlielumi ME grupā ir līdzīgi kā fiktīvas operācijas grupā, un laika gaitā iegulšanas vietā nav novērotas būtiskas signāla izmaiņas. (C) NPE grupā zemais signāls ir skaidri redzams T1W secībā, un jauktais signāls un zemais signāls ir skaidri redzams T2W secībā. No 12 nedēļu perioda līdz 20 nedēļu periodam sporādiski augstie signāli ap zemajiem signāliem T2W secībā samazinās.
Acīmredzamu kaulu hiperplāziju var novērot mugurkaula ķermeņa implantācijas vietā NPE grupā, un kaulu hiperplāzija notiek ātrāk no 12 līdz 20 nedēļām (2.C att.), salīdzinot ar NPE grupu, būtiskas izmaiņas modelētajā skriemelī nav novērotas. ķermeņi; Fiktīvā grupa un ME grupa (2.C att.) 2A,B).
(A) Skriemeļa ķermeņa virsma implantētajā daļā ir ļoti gluda, caurums labi sadzīst, un mugurkaula ķermenī nav hiperplāzijas. (B) Implantētās vietas forma ME grupā ir līdzīga fiktīvu operāciju grupai, un laika gaitā implantētās vietas izskatā nav acīmredzamu izmaiņu. (C) NPE grupā implantētajā vietā radās kaulu hiperplāzija. Kaulu hiperplāzija strauji palielinājās un pat paplašinājās caur starpskriemeļu disku līdz kontralaterālajam mugurkaula ķermenim.
Histoloģiskā analīze sniedz sīkāku informāciju par kaulu veidošanos. 3. attēlā parādītas pēcoperācijas sekciju fotogrāfijas, kas iekrāsotas ar H&E. Fiktīvas operācijas grupā hondrocīti bija labi sakārtoti un netika konstatēta šūnu proliferācija (3.A att.). Situācija ME grupā bija līdzīga kā fiktīvas operācijas grupā (3.B att.). Tomēr NPE grupā implantācijas vietā tika novērots liels hondrocītu skaits un NP līdzīgu šūnu proliferācija (3.C att.);
(A) Trabekulas var redzēt netālu no gala plāksnes, hondrocīti ir glīti sakārtoti ar vienādu šūnu izmēru un formu un bez proliferācijas (40 reizes). (B) Implantācijas vietas stāvoklis ME grupā ir līdzīgs fiktīvas grupas stāvoklim. Var redzēt trabekulas un hondrocītus, bet implantācijas vietā nav acīmredzamas proliferācijas (40 reizes). (B) Var redzēt, ka hondrocīti un NP līdzīgas šūnas ievērojami vairojas, un hondrocītu forma un izmērs ir nevienmērīgi (40 reizes).
Interleikīna 4 (IL-4) mRNS, interleikīna 17 (IL-17) mRNS un interferona γ (IFN-γ) mRNS ekspresija tika novērota gan NPE, gan ME grupās. Salīdzinot mērķa gēnu ekspresijas līmeņus, IL-4, IL-17 un IFN-γ gēnu ekspresijas NPE grupā bija ievērojami paaugstinātas, salīdzinot ar ME grupu un fiktīvo operāciju grupu (4. att.). (P < 0,05). Salīdzinot ar viltus operāciju grupu, IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresijas līmeņi ME grupā palielinājās tikai nedaudz un nesasniedza statistiskās izmaiņas (P > 0,05).
IL-4, IL-17 un IFN-γ mRNS ekspresija NPE grupā uzrādīja ievērojami augstāku tendenci nekā fiktīvas operācijas grupā un ME grupā (P < 0,05).
Turpretim ekspresijas līmeņi ME grupā neuzrādīja būtisku atšķirību (P> 0, 05).
Western blot analīze tika veikta, izmantojot komerciāli pieejamas antivielas pret IL-4 un IL-17, lai apstiprinātu izmainīto mRNS ekspresijas modeli. Kā parādīts 5.A un B attēlā, salīdzinot ar ME grupu un fiktīvu operāciju grupu, IL-4 un IL-17 proteīna līmenis NPE grupā bija ievērojami paaugstināts (P < 0,05). Salīdzinot ar fiktīvu operāciju grupu, arī IL-4 un IL-17 proteīna līmenis ME grupā neizdevās sasniegt statistiski nozīmīgas izmaiņas (P> 0,05).
(A) IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis NPE grupā bija ievērojami augstāks nekā ME grupā un placebo grupā (P < 0,05). (B) Western blot histogramma.
Tā kā operācijas laikā iegūto cilvēku paraugu skaits ir ierobežots, skaidri un detalizēti pētījumi par MC patoģenēzi ir nedaudz sarežģīti. Mēs mēģinājām izveidot MC dzīvnieku modeli, lai izpētītu tā iespējamos patoloģiskos mehānismus. Tajā pašā laikā radioloģiskais novērtējums, histoloģiskais novērtējums un molekulāri bioloģiskais novērtējums tika izmantots, lai sekotu NP autotransplanta izraisītā MC gaitai. Rezultātā NP implantācijas modelis izraisīja pakāpeniskas signāla intensitātes izmaiņas no 12 nedēļām uz 20 nedēļām (jaukts zems signāls T1W sekvencēs un zems signāls T2W sekvencēs), norādot uz izmaiņām audos un histoloģisko un molekulāro. bioloģiskie novērtējumi apstiprināja radioloģiskā pētījuma rezultātus.
Šī eksperimenta rezultāti liecina, ka NPE grupā mugurkaula ķermeņa pārkāpuma vietā notika vizuālas un histoloģiskas izmaiņas. Tajā pašā laikā tika novērota IL-4, IL-17 un IFN-γ gēnu, kā arī IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija, kas liecina, ka mugurkaula autologā kodola pulposa audu pārkāpums. ķermenis var izraisīt virkni signālu un morfoloģiskas izmaiņas. Ir viegli konstatēt, ka dzīvnieku modeļa skriemeļu ķermeņu signāla raksturlielumi (zems signāls T1W secībā, jaukts signāls un zems signāls T2W secībā) ir ļoti līdzīgi cilvēka skriemeļu šūnu signāla īpašībām, un arī MRI raksturlielumi. apstiprina histoloģijas un rupjās anatomijas novērojumus, tas ir, izmaiņas mugurkaula ķermeņa šūnās ir progresīvas. Lai gan akūtas traumas izraisīta iekaisuma reakcija var parādīties drīz pēc punkcijas, MRI rezultāti parādīja, ka pakāpeniski pieaugošas signāla izmaiņas parādījās 12 nedēļas pēc punkcijas un saglabājās līdz 20 nedēļām bez jebkādām atveseļošanās pazīmēm vai MRI izmaiņu maiņas. Šie rezultāti liecina, ka autologais skriemeļu NP ir uzticama metode progresējošas MV noteikšanai trušiem.
Šis punkcijas modelis prasa atbilstošas prasmes, laiku un ķirurģiskas pūles. Sākotnējos eksperimentos paravertebrālo saišu struktūru sadalīšana vai pārmērīga stimulēšana var izraisīt mugurkaula osteofītu veidošanos. Jāuzmanās, lai nesabojātu vai nekairinātu blakus esošos diskus. Tā kā iespiešanās dziļums ir jākontrolē, lai iegūtu konsekventus un reproducējamus rezultātus, mēs manuāli izveidojām aizbāzni, nogriežot 3 mm garas adatas apvalku. Izmantojot šo spraudni, tiek nodrošināts vienmērīgs urbšanas dziļums mugurkaula ķermenī. Sākotnējos eksperimentos trīs operācijā iesaistītie ortopēdiskie ķirurgi atklāja, ka ar 16. izmēra adatām ir vieglāk strādāt nekā ar 18. izmēra adatām vai citām metodēm. Lai izvairītos no pārmērīgas asiņošanas urbšanas laikā, adatas turēšana kādu laiku nekustīga nodrošinās piemērotāku ievadīšanas caurumu, kas liecina, ka šādā veidā var kontrolēt noteiktu MC pakāpi.
Lai gan daudzi pētījumi ir vērsti uz MC, maz ir zināms par MC25, 26, 27 etioloģiju un patoģenēzi. Pamatojoties uz mūsu iepriekšējiem pētījumiem, mēs noskaidrojām, ka autoimunitātei ir galvenā loma MC12 rašanās un attīstības procesā. Šajā pētījumā tika pārbaudīta IL-4, IL-17 un IFN-γ kvantitatīvā ekspresija, kas ir galvenie CD4+ šūnu diferenciācijas ceļi pēc antigēna stimulācijas. Mūsu pētījumā, salīdzinot ar negatīvo grupu, NPE grupai bija augstāka IL-4, IL-17 un IFN-γ ekspresija, un arī IL-4 un IL-17 olbaltumvielu līmenis bija augstāks.
Klīniski IL-17 mRNS ekspresija ir palielināta NP šūnās pacientiem ar diska trūci28. Paaugstināts IL-4 un IFN-γ ekspresijas līmenis tika konstatēts arī akūtā nesaspiežošā diska trūces modelī, salīdzinot ar veselām kontrolēm29. IL-17 spēlē galveno lomu iekaisumos, audu ievainojumos autoimūno slimību gadījumā30 un uzlabo imūnreakciju pret IFN-γ31. Ir ziņots par pastiprinātu IL-17 izraisītu audu bojājumu MRL/lpr pelēm32 un pret autoimunitāti jutīgām pelēm33. IL-4 var inhibēt proinflammatorisku citokīnu (piemēram, IL-1β un TNFα) ekspresiju un makrofāgu aktivāciju34. Tika ziņots, ka IL-4 mRNS ekspresija NPE grupā bija atšķirīga, salīdzinot ar IL-17 un IFN-γ tajā pašā laika punktā; IFN-γ mRNS ekspresija NPE grupā bija ievērojami augstāka nekā citās grupās. Tāpēc IFN-γ ražošana var būt NP interkalācijas izraisītās iekaisuma reakcijas starpnieks. Pētījumi ir parādījuši, ka IFN-γ ražo vairāki šūnu tipi, tostarp aktivētās 1. tipa palīgšūnas, dabiskās killer šūnas un makrofāgi35, 36, un tas ir galvenais iekaisuma citokīns, kas veicina imūnās atbildes37.
Šis pētījums liecina, ka autoimūna reakcija var būt saistīta ar MC rašanos un attīstību. Luoma et al. atklāja, ka MC un ievērojamā NP signāla raksturlielumi ir līdzīgi MRI, un abi uzrāda augstu signālu T2W secībā38. Ir apstiprināts, ka daži citokīni ir cieši saistīti ar MC rašanos, piemēram, IL-139. Ma et al. ierosināja, ka NP izvirzījumam uz augšu vai uz leju var būt liela ietekme uz MC12 rašanos un attīstību. Bobechko40 un Herzbein et al.41 ziņoja, ka NP ir imūntoleranti audi, kas nevar iekļūt asinsvadu cirkulācijā kopš dzimšanas. NP izvirzījumi ievada svešķermeņus asins apgādē, tādējādi veicinot lokālas autoimūnas reakcijas42. Autoimūnas reakcijas var izraisīt lielu skaitu imūno faktoru, un, ja šie faktori tiek nepārtraukti pakļauti audiem, tie var izraisīt izmaiņas signalizācijā43. Šajā pētījumā IL-4, IL-17 un IFN-γ pārmērīga ekspresija ir tipiski imūnsistēmas faktori, kas vēl vairāk pierāda ciešo saistību starp NP un MCs44. Šis dzīvnieku modelis labi atdarina NP izrāvienu un iekļūšanu gala plāksnē. Šis process vēl vairāk atklāja autoimunitātes ietekmi uz MC.
Kā gaidīts, šis dzīvnieku modelis nodrošina mums iespējamu platformu MC pētīšanai. Tomēr šim modelim joprojām ir daži ierobežojumi: pirmkārt, dzīvnieku novērošanas fāzē daži starpposma truši ir jāeitanizē histoloģiskai un molekulārās bioloģijas pārbaudei, tāpēc daži dzīvnieki laika gaitā “iziet no lietošanas”. Otrkārt, lai gan šajā pētījumā ir noteikti trīs laika punkti, diemžēl mēs modelējām tikai viena veida MC (Modic tipa I izmaiņas), tāpēc ar to nepietiek, lai attēlotu cilvēka slimību attīstības procesu, un ir jāiestata vairāk laika punktu labāk novērot visas signāla izmaiņas. Treškārt, izmaiņas audu struktūrā patiešām var skaidri parādīt ar histoloģisku krāsošanu, taču dažas specializētas metodes var labāk atklāt šī modeļa mikrostrukturālās izmaiņas. Piemēram, polarizētās gaismas mikroskopija tika izmantota, lai analizētu fibro skrimšļa veidošanos trušu starpskriemeļu diskos45. NP ilgtermiņa ietekme uz MC un gala plāksni prasa turpmāku izpēti.
Piecdesmit četri Jaunzēlandes balto trušu tēviņi (svars aptuveni 2,5–3 kg, vecums 3–3,5 mēneši) tika nejauši sadalīti fiktīvu operāciju grupā, muskuļu implantācijas grupā (ME grupa) un nervu sakņu implantācijas grupā (NPE grupa). Visas eksperimentālās procedūras apstiprināja Tjandzjiņas slimnīcas ētikas komiteja, un eksperimentālās metodes tika veiktas stingri saskaņā ar apstiprinātajām vadlīnijām.
Ir veikti daži uzlabojumi S. Sobajima 46 ķirurģiskajā tehnikā. Katrs trusis tika novietots sānu guļus stāvoklī, un piecu secīgu jostas starpskriemeļu disku (IVD) priekšējā virsma tika pakļauta, izmantojot posterolaterālo retroperitoneālo pieeju. Katram trusis tika veikta vispārējā anestēzija (20% uretāna, 5 ml/kg caur auss vēnu). Tika veikts garenisks ādas griezums no ribu apakšējās malas līdz iegurņa malai, 2 cm ventrāli līdz paravertebrālajiem muskuļiem. Labais anterolaterālais mugurkauls no L1 līdz L6 tika atklāts, asi un neasi sadalot virsējos zemādas audus, retroperitoneālos audus un muskuļus (6.A attēls). Diska līmenis tika noteikts, izmantojot iegurņa malu kā anatomisku orientieri L5-L6 diska līmenim. Izmantojiet 16 izmēra caurduršanas adatu, lai 3 mm dziļumā izurbtu caurumu netālu no L5 skriemeļa gala plāksnes (6.B attēls). Izmantojiet 5 ml šļirci, lai aspirētu L1-L2 starpskriemeļu diskā esošo autologo nucleus pulposus (6.C attēls). Noņemiet pulposus vai muskuļus atbilstoši katras grupas prasībām. Pēc urbuma padziļināšanas uz dziļās fascijas, virspusējās fascijas un ādas tiek uzliktas absorbējošas šuves, rūpējoties, lai operācijas laikā netiktu bojāti mugurkaula ķermeņa periosteālie audi.
(A) L5–L6 disks tiek eksponēts, izmantojot posterolaterālu retroperitoneālu pieeju. (B) Izmantojiet 16 izmēra adatu, lai urbtu caurumu pie L5 gala plāksnes. (C) tiek savākti autologi MF.
Vispārējā anestēzija tika ievadīta ar 20% uretānu (5 ml/kg), ko ievadīja caur auss vēnu, un mugurkaula jostas daļas rentgenogrāfija tika atkārtota 12., 16. un 20. nedēļā pēc operācijas.
Trušus nogalināja, intramuskulāri ievadot ketamīnu (25, 0 mg / kg) un intravenozi nātrija pentobarbitālu (1, 2 g / kg) 12, 16 un 20 nedēļas pēc operācijas. Viss mugurkauls tika noņemts histoloģiskai analīzei un tika veikta reāla analīze. Lai noteiktu imūno faktoru izmaiņas, tika izmantota kvantitatīvā reversā transkripcija (RT-qPCR) un Western blotēšana.
MRI izmeklējumi tika veikti trušiem, izmantojot 3,0 T klīnisko magnētu (GE Medical Systems, Florence, SC), kas aprīkots ar ortogonālu ekstremitāšu spoles uztvērēju. Truši tika anestēzēti ar 20% uretānu (5 ml/kg) caur auss vēnu un pēc tam novietoti guļus magnētā ar jostasvietu, kas centrēta uz 5 collu diametra apļveida virsmas spoli (GE Medical Systems). Tika iegūti koronālie T2 svērtie lokalizatora attēli (TR, 1445 ms; TE, 37 ms), lai noteiktu jostas diska atrašanās vietu no L3–L4 līdz L5–L6. Sagitālās plaknes T2 svērtās šķēles tika iegūtas ar šādiem iestatījumiem: ātra spin-atbalss secība ar atkārtošanās laiku (TR) 2200 ms un atbalss laiku (TE) 70 ms, matrica; 260 un astoņu stimulu redzes lauks; Griešanas biezums bija 2 mm, atstarpe 0,2 mm.
Pēc pēdējās fotogrāfijas uzņemšanas un pēdējā truša nogalināšanas histoloģiskai izmeklēšanai tika izņemti fiktīvie, muskuļos iegultie un NP diski. Audi tika fiksēti 10% neitrālā buferētā formalīnā 1 nedēļu, atkaļķoti ar etilēndiamīntetraetiķskābi un sadalīti ar parafīnu. Audu bloki tika iestrādāti parafīnā un, izmantojot mikrotomu, sagriezti sagitālās sekcijās (5 μm biezumā). Sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E).
Pēc starpskriemeļu disku savākšanas no katras grupas trušiem kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot UNIQ-10 kolonnu (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem un ImProm II reversās transkripcijas sistēmu (Promega Inc. , Madisona, WI, ASV). Tika veikta reversā transkripcija.
RT-qPCR tika veikta, izmantojot Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ASV) un SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. PCR reakcijas tilpums bija 20 μl, un tajā bija 1, 5 μl atšķaidīta cDNS un 0, 2 μM katra praimera. Gruntējumus izstrādāja uzņēmums OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA), un tos ražoja Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Ķīna) (1. tabula). Tika izmantoti šādi termiskās cikla apstākļi: sākotnējais polimerāzes aktivācijas posms 94 ° C temperatūrā 2 minūtes, pēc tam 40 cikli pa 15 sekundēm katrs 94 ° C temperatūrā šablona denaturācijai, atkausēšana 1 minūti 60 ° C temperatūrā, pagarināšana un fluorescence. mērījumi tika veikti 1 minūti 72 °C temperatūrā. Visi paraugi tika pastiprināti trīs reizes, un vidējā vērtība tika izmantota RT-qPCR analīzei. Pastiprināšanas dati tika analizēti, izmantojot FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ASV). IL-4, IL-17 un IFN-γ gēnu ekspresija tika normalizēta līdz endogēnai kontrolei (ACTB). Mērķa mRNS relatīvie ekspresijas līmeņi tika aprēķināti, izmantojot 2-ΔΔCT metodi.
Kopējais proteīns tika ekstrahēts no audiem, izmantojot audu homogenizatoru RIPA līzes buferšķīdumā (kas satur proteāzes un fosfatāzes inhibitoru kokteili), un pēc tam centrifugēja ar ātrumu 13 000 apgr./min 20 minūtes 4 ° C temperatūrā, lai noņemtu audu atliekas. Katrā joslā tika ielādēti piecdesmit mikrogrami proteīna, atdalīti ar 10% SDS-PAGE un pēc tam pārnesti uz PVDF membrānu. Bloķēšana tika veikta 5% beztauku sausā pienā Tris buferētā fizioloģiskā šķīdumā (TBS), kas satur 0, 1% Tween 20, 1 stundu istabas temperatūrā. Membrānu inkubēja ar truša anti-dekorīna primāro antivielu (atšķaidīts 1:200; Boster, Uhaņa, Ķīna) (atšķaidīts 1:200; Bioss, Pekina, Ķīna) nakti 4 °C temperatūrā un reaģēja otrajās dienās; ar sekundāro antivielu (kazas anti-trušu imūnglobulīnu G atšķaidījumā 1:40 000) kombinācijā ar mārrutku peroksidāzi (Boster, Uhana, Ķīna) 1 stundu istabas temperatūrā. Western blot signāli tika atklāti ar palielinātu hemiluminiscenci uz hemiluminiscējošās membrānas pēc rentgena apstarošanas. Densitometriskajai analīzei bloti tika skenēti un kvantitatīvi noteikti, izmantojot BandScan programmatūru, un rezultāti tika izteikti kā mērķa gēna imūnreaktivitātes attiecība pret tubulīna imūnreaktivitāti.
Statistiskie aprēķini veikti, izmantojot SPSS16.0 programmatūras pakotni (SPSS, ASV). Pētījuma laikā savāktie dati tika izteikti kā vidējā ± standarta novirze (vidējais ± SD) un analizēti, izmantojot vienvirziena atkārtotu mērījumu dispersijas analīzi (ANOVA), lai noteiktu atšķirības starp abām grupām. P < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.
Tādējādi MC dzīvnieku modeļa izveide, implantējot autologos NP mugurkaula ķermenī un veicot makroanatomisko novērošanu, MRI analīzi, histoloģisko novērtējumu un molekulāri bioloģisko analīzi, var kļūt par svarīgu instrumentu cilvēka MC mehānismu novērtēšanai un izpratnei un jaunu terapeitisku izstrāžu izstrādei. iejaukšanās.
Kā citēt šo rakstu: Han, C. et al. Modic izmaiņu dzīvnieku modelis tika izveidots, implantējot mugurkaula jostas daļas subhondrālajā kaulā autologo nucleus pulposus. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., un Boos, N. Mugurkaula jostas daļas magnētiskās rezonanses attēlveidošana: diska trūces un aiztures izplatība, nervu sakņu saspiešana, gala plāksnes anomālijas un fasetes locītavu osteoartrīts asimptomātiskiem brīvprātīgajiem . likme. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, un Leboeuf-Eed, K. Modic izmaiņas un to saistība ar klīniskajiem atklājumiem. European Spine Journal: Eiropas Mugurkaula biedrības, Eiropas Mugurkaula deformācijas biedrības un Eiropas Dzemdes kakla mugurkaula pētījumu biedrības oficiālā publikācija 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M. u.c. Modiskas izmaiņas jostas skriemeļu gala plāksnēs: izplatība un saistība ar muguras sāpēm un išiass pusmūža vīriešiem. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., un Dalinka, M. MRI kaulu smadzeņu izmaiņas pie gala plāksnes deģeneratīvas slimības mugurkaula jostas daļā. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ un Carter, JR. Deģeneratīva disku slimība: mugurkaula smadzeņu izmaiņu novērtējums ar MRI. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS un Carter, JR. Deģeneratīvas disku slimības attēlveidošana. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensens, TS u.c. Neovertebrālās gala plāksnes (Modic) prognozētāji signalizē par izmaiņām vispārējā populācijā. European Spine Journal: Eiropas Mugurkaula biedrības, Eiropas Mugurkaula deformācijas biedrības un Eiropas Dzemdes kakla mugurkaula pētījumu biedrības oficiālā publikācija, 19. nodaļa, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB un Mannisch, K. Modic izmaiņas pēc jostas diska trūces. European Spine Journal : Eiropas Mugurkaula biedrības, Eiropas Mugurkaula deformācijas biedrības un Eiropas Dzemdes kakla mugurkaula pētījumu biedrības oficiālā publikācija 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. Modic type I changes can ennustaa strauji progresējošu deformācijas disku deģenerāciju: 1-year prospective study. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ un Fan, SW Modic izmaiņas: iespējamie cēloņi un ieguldījums jostas diska deģenerācijā. Medicīniskās hipotēzes 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Iekšējā diska plīsums. Diska prolapss problēmas pēc 50 gadiem. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Izlikšanas laiks: 13. decembris 2024