Cilvēka skeleta muskuļu šķiedru heterogenitāte ārpus miozīna smagās ķēdes

Paldies, ka apmeklējāt vietni nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot jaunāko pārlūkprogrammas versiju (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Turklāt, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, šajā vietnē nebūs stilu un JavaScript.
Skeleta muskuļi ir heterogēni audi, kas galvenokārt sastāv no miofibrilām, kuras cilvēkiem parasti klasificē trīs tipos: viens “lēns” (1. tips) un divi “ātrie” (2A un 2X tipi). Tomēr heterogenitāte starp tradicionālajiem miofibrilu tipiem un to iekšienē joprojām ir vāji izprasta. Mēs izmantojām transkriptomiskas un proteomiskas pieejas attiecīgi 1050 un 1038 atsevišķām miofibrilām no cilvēka vastus lateralis. Proteomikas pētījumā piedalījās vīrieši, bet transkriptomikas pētījumā - 10 vīrieši un 2 sievietes. Papildus miozīna smagās ķēdes izoformām mēs identificējām vielmaiņas proteīnus, ribosomu proteīnus un šūnu savienojumu proteīnus kā daudzdimensionālas starpmiofibrilu mainības avotus. Turklāt, neskatoties uz lēno un ātro šķiedru klasteru identificēšanu, mūsu dati liecina, ka 2X tipa šķiedras fenotipiski neatšķiras no citām ātrās raušanās šķiedrām. Turklāt uz miozīna smagās ķēdes balstīta klasifikācija nav pietiekama, lai aprakstītu miofibrilu fenotipu nemalīna miopātijās. Kopumā mūsu dati liecina par daudzdimensionālu miofibru heterogenitāti, un variācijas avoti sniedzas tālāk par miozīna smagās ķēdes izoformām.
Šūnu heterogenitāte ir visu bioloģisko sistēmu raksturīga iezīme, kas ļauj šūnām specializēties, lai apmierinātu dažādas audu un šūnu vajadzības.1 Tradicionālais skeleta muskuļu šķiedru heterogenitātes uzskats ir tāds, ka motorie neironi nosaka šķiedru tipu motorajā vienībā un ka šķiedru tipu (t.i., 1. tips, 2A tips un 2X tips cilvēkiem) nosaka miozīna smagās ķēdes (MYH) izoformu īpašības.2 Sākotnēji tas balstījās uz to pH ATPāzes nestabilitāti,3,4 un vēlāk uz to MYH molekulāro ekspresiju.5 Tomēr, identificējot un pēc tam pieņemot "jauktas" šķiedras, kas vienlaikus ekspresē vairākus MYH dažādās proporcijās, skeleta muskuļu šķiedras arvien vairāk tiek uzskatītas par nepārtrauktu veselumu, nevis par atšķirīgiem šķiedru tipiem.6 Neskatoties uz to, šī joma joprojām lielā mērā balstās uz MYH kā galveno miošķiedru klasifikācijas klasifikatoru, un šo viedokli, iespējams, ietekmē agrīno grauzēju pētījumu ierobežojumi un ievērojamās neobjektivitātes, kuru MYH ekspresijas profili un šķiedru tipu diapazons atšķiras no cilvēkiem.2 Situāciju vēl vairāk sarežģī fakts, ka dažādiem cilvēka skeleta muskuļiem ir daudzveidīgs šķiedru tipu klāsts.7 Laterālais virsējais muskulis ir jaukts muskulis ar starpposma (un tāpēc reprezentatīvu) MYH ekspresijas profilu.7 Turklāt tā vienkāršā paraugu ņemšana padara to par vislabāk pētīto muskuli cilvēkiem.
Tādējādi objektīva skeleta muskuļu šķiedru daudzveidības izpēte, izmantojot jaudīgus “-omikas” rīkus, ir kritiski svarīga, bet arī sarežģīta, daļēji skeleta muskuļu šķiedru daudzkodolu rakstura dēļ. Tomēr transkriptomikas8,9 un proteomikas10 tehnoloģijas pēdējos gados ir piedzīvojušas jutības revolūciju, pateicoties dažādiem tehnoloģiskiem sasniegumiem, ļaujot analizēt skeleta muskuļus ar vienas šķiedras izšķirtspēju. Tā rezultātā ir panākts ievērojams progress vienas šķiedras daudzveidības un to reakcijas uz atrofiskiem stimuliem un novecošanos raksturošanā11,12,13,14,15,16,17,18. Svarīgi ir tas, ka šiem tehnoloģiskajiem sasniegumiem ir klīniska pielietošana, kas ļauj detalizētāk un precīzāk raksturot ar slimību saistītu disregulāciju. Piemēram, nemalīna miopātijas, vienas no visbiežāk sastopamajām iedzimtajām muskuļu slimībām (MIM 605355 un MIM 161800), patofizioloģija ir sarežģīta un mulsinoša.19,20 Tāpēc labāka skeleta muskuļu šķiedru disregulācijas raksturošana varētu ievērojami uzlabot mūsu izpratni par šo slimību.
Mēs izstrādājām metodes atsevišķu skeleta muskuļu šķiedru transkriptomiskai un proteomiskai analīzei, kas manuāli izolētas no cilvēka biopsijas paraugiem, un pielietojām tās tūkstošiem šķiedru, ļaujot mums izpētīt cilvēka skeleta muskuļu šķiedru šūnu heterogenitāti. Šī darba gaitā mēs parādījām muskuļu šķiedru transkriptiskās un proteomiskās fenotipēšanas iespējas un identificējām vielmaiņas, ribosomu un šūnu savienojumu proteīnus kā nozīmīgus starpšķiedru mainīguma avotus. Turklāt, izmantojot šo proteomikas darbplūsmu, mēs raksturojām nematodu miopātijas klīnisko nozīmi atsevišķās skeleta muskuļu šķiedrās, atklājot koordinētu nobīdi uz neoksidatīvām šķiedrām neatkarīgi no šķiedru tipa, pamatojoties uz MYH.
Lai izpētītu cilvēka skeleta muskuļu šķiedru heterogenitāti, mēs izstrādājām divas darbplūsmas, lai nodrošinātu atsevišķu skeleta muskuļu šķiedru transkriptomu un proteomu analīzi (1.A attēls un 1.A papildattēls). Mēs izstrādājām un optimizējām vairākus metodoloģiskus soļus, sākot no paraugu uzglabāšanas un RNS un olbaltumvielu integritātes saglabāšanas līdz katras pieejas caurlaidspējas optimizēšanai. Transkriptomu analīzei tas tika panākts, ievietojot paraugam specifiskus molekulāros svītrkodus reversās transkripcijas sākotnējā posmā, ļaujot apvienot 96 šķiedras efektīvai tālākapstrādei. Dziļāka sekvencēšana (±1 miljons lasījumu uz šķiedru) salīdzinājumā ar tradicionālajām vienas šūnas pieejām vēl vairāk bagātināja transkriptomu datus.21 Proteomikai mēs izmantojām īsu hromatogrāfisko gradientu (21 minūte) apvienojumā ar DIA-PASEF datu iegūšanu timsTOF masas spektrometrā, lai optimizētu proteomu dziļumu, vienlaikus saglabājot augstu caurlaidspēju.22,23 Lai izpētītu veselīgu skeleta muskuļu šķiedru heterogenitāti, mēs raksturojām 1050 atsevišķu šķiedru transkriptomas no 14 veseliem pieaugušiem donoriem un 1038 šķiedru proteomas no 5 veseliem pieaugušiem donoriem (1. papildtabula). Šajā rakstā šie datu kopumi tiek saukti attiecīgi par 1000 šķiedru transkriptomām un proteomām. Mūsu pieeja 1000 šķiedru transkriptomikas un proteomikas analīzēs kopumā atklāja 27 237 transkriptus un 2983 proteīnus (1.A attēls, 1.–2. papildu datu kopa). Pēc transkriptomikas un proteomikas datu kopu filtrēšanas, lai atrastu >1000 atklātus gēnus un 50 % derīgas vērtības uz katru šķiedru, turpmākās bioinformātikas analīzes tika veiktas attiecīgi 925 un 974 šķiedrām transkriptomā un proteomā. Pēc filtrēšanas vidēji uz katru šķiedru tika atklāti 4257 ± 1557 gēni un 2015 ± 234 proteīni (vidējais ± SD), ar ierobežotu starpindividuālo mainīgumu (1.B–C papildu attēli, 3.–4. papildu datu kopa). Tomēr viena subjekta mainīgums bija izteiktāks starp dalībniekiem, iespējams, RNS/proteīnu ražas atšķirību dēļ starp dažāda garuma un šķērsgriezuma laukuma šķiedrām. Lielākajai daļai olbaltumvielu (>2000) variācijas koeficients bija zem 20% (1.D papildattēls). Abas metodes ļāva uztvert plašu transkriptu un olbaltumvielu dinamisko diapazonu ar izteikti izteiktiem signatūrām, kas ir svarīgas muskuļu kontrakcijai (piemēram, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (1.E–F papildattēli). Lielākā daļa identificēto pazīmju bija kopīgas transkriptomikas un proteomikas datu kopās (1.G papildattēls), un šo pazīmju vidējās UMI/LFQ intensitātes bija samērā labi korelētas (r = 0,52) (1.H papildattēls).
Transkriptomikas un proteomikas darbplūsma (izveidota, izmantojot BioRender.com). BD Dinamiskā diapazona līknes MYH7, MYH2 un MYH1 un aprēķinātās robežvērtības šķiedru tipa piešķiršanai. E, F MYH ekspresijas sadalījums pa šķiedrām transkriptomikas un proteomikas datu kopās. G, H Vienveidīgās daudzveidības aproksimācijas un projekcijas (UMAP) diagrammas transkriptomikai un proteomikai, kas iekrāsotas pēc MYH bāzes šķiedru tipa. I, J Iezīmju diagrammas, kas parāda MYH7, MYH2 un MYH1 ekspresiju transkriptomikas un proteomikas datu kopās.
Sākotnēji mēs centāmies piešķirt katrai šķiedrai uz MYH balstītu šķiedru tipu, izmantojot optimizētu pieeju, kas izmanto MYH ekspresijas augsto jutību un dinamisko diapazonu omikas datu kopās. Iepriekšējos pētījumos tika izmantotas patvaļīgas robežvērtības, lai šķiedras apzīmētu kā tīru 1. tipu, 2A tipu, 2X tipu vai jauktu, pamatojoties uz dažādu MYH ekspresijas fiksētu procentuālo daudzumu11,14,24. Mēs izmantojām atšķirīgu pieeju, kurā katras šķiedras ekspresija tika sarindota pēc MYH, ko izmantojām šķiedru tipizēšanai: MYH7, MYH2 un MYH1, kas atbilst attiecīgi 1., 2A un 2X tipa šķiedrām. Pēc tam mēs matemātiski aprēķinājām katras iegūtās līknes apakšējo līkuma punktu un izmantojām to kā robežvērtību, lai katram MYH piešķirtu šķiedras kā pozitīvas (virs sliekšņa) vai negatīvas (zem sliekšņa) (1.B–D attēls). Šie dati parāda, ka MYH7 (1.B attēls) un MYH2 (1.C attēls) ir atšķirīgāki ieslēgšanas/izslēgšanas ekspresijas profili RNS līmenī salīdzinājumā ar olbaltumvielu līmeni. Patiešām, olbaltumvielu līmenī ļoti maz šķiedru neizpaudīja MYH7, un nevienai šķiedrai nebija 100% MYH2 ekspresijas. Pēc tam mēs izmantojām iepriekš noteiktus ekspresijas sliekšņus, lai piešķirtu MYH bāzes šķiedru tipus visām šķiedrām katrā datu kopā. Piemēram, MYH7+/MYH2-/MYH1- šķiedras tika piešķirtas 1. tipam, savukārt MYH7-/MYH2+/MYH1+ šķiedras tika piešķirtas jauktajam 2A/2X tipam (pilnu aprakstu skatīt 2. papildtabulā). Apvienojot visas šķiedras, mēs novērojām ievērojami līdzīgu MYH bāzes šķiedru tipu sadalījumu gan RNS (1.E attēls), gan olbaltumvielu (1.F attēls) līmenī, savukārt MYH bāzes šķiedru tipu relatīvais sastāvs dažādiem indivīdiem atšķīrās, kā paredzēts (2.A papildattēls). Lielākā daļa šķiedru tika klasificētas kā tīrs 1. tips (34–35%) vai 2A tips (36–38%), lai gan tika konstatēts arī ievērojams skaits jaukta tipa 2A/2X šķiedru (16–19%). Pārsteidzoša atšķirība ir tā, ka tīras 2X tipa šķiedras varēja noteikt tikai RNS līmenī, bet ne olbaltumvielu līmenī, kas liecina, ka ātra MYH ekspresija vismaz daļēji tiek regulēta pēc transkripcijas.
Mēs validējām savu uz proteomiku balstīto MYH šķiedru tipizēšanas metodi, izmantojot uz antivielām balstītu punktveida blotēšanu, un abas metodes panāca 100% atbilstību tīru 1. tipa un 2A tipa šķiedru identificēšanā (sk. 2.B papildattēlu). Tomēr uz proteomiku balstītā pieeja bija jutīgāka, efektīvāka jauktu šķiedru identificēšanā un katra MYH gēna proporcijas kvantitatīvā noteikšanā katrā šķiedrā. Šie dati parāda objektīvas, ļoti jutīgas uz omiku balstītas pieejas efektivitāti skeleta muskuļu šķiedru tipu raksturošanā.
Pēc tam mēs izmantojām transkriptomikas un proteomikas sniegto apvienoto informāciju, lai objektīvi klasificētu miofibras, pamatojoties uz to pilno transkriptomu vai proteomu. Izmantojot vienotās kolektora aproksimācijas un projekcijas (UMAP) metodi, lai samazinātu dimensiju līdz sešām galvenajām komponentēm (3.A–B papildattēli), mēs varējām vizualizēt miofibru mainīgumu transkriptomā (1.G attēls) un proteomā (1.H attēls). Jāatzīmē, ka miofibras netika grupētas pēc dalībniekiem (3.C–D papildattēli) vai testēšanas dienām (3.E papildattēls) ne transkriptomikas, ne proteomikas datu kopās, kas liecina, ka skeleta muskuļu šķiedru mainīgums viena subjekta ietvaros ir lielāks nekā mainīgums starp subjektiem. UMAP diagrammā parādījās divi atšķirīgi klasteri, kas attēlo “ātrās” un “lēnās” miofibras (1.G–H attēls). MYH7+ (lēnās) miošķiedras bija koncentrētas UMAP1 pozitīvajā polā, savukārt MYH2+ un MYH1+ (ātrās) miošķiedras bija koncentrētas UMAP1 negatīvajā polā (1.I–J attēls). Tomēr, pamatojoties uz MYH ekspresiju, netika nošķirti ātrās raustīšanās šķiedru veidi (t.i., 2A tips, 2X tips vai jaukts 2A/2X), kas liecina, ka MYH1 (1.I–J attēls) vai citu klasisko 2X miošķiedru marķieru, piemēram, ACTN3 vai MYLK2 (4.A–B papildattēli), ekspresija neatšķir dažādus miošķiedru tipus, ņemot vērā visu transkriptomu vai proteomu. Turklāt, salīdzinot ar MYH2 un MYH7, tikai daži transkripti vai proteīni bija pozitīvi korelēti ar MYH1 (4.C–H papildattēli), kas liecina, ka MYH1 pārpilnība pilnībā neatspoguļo miošķiedru transkriptomu/proteomu. Līdzīgi secinājumi tika izdarīti, novērtējot trīs MYH izoformu jaukto ekspresiju UMAP līmenī (4.I–J. papildattēls). Tādējādi, lai gan 2X šķiedras var identificēt transkripta līmenī, pamatojoties tikai uz MYH kvantifikāciju, MYH1+ šķiedras nav atšķiramas no citām ātrajām šķiedrām, ņemot vērā visu transkriptomu vai proteomu.
Sākotnēji izpētot lēno šķiedru heterogenitāti ārpus MYH, mēs novērtējām četrus atzītus lēno šķiedru tipam specifiskus proteīnus: TPM3, TNNT1, MYL3 un ATP2A22. Lēno šķiedru apakštipi uzrādīja augstu, lai arī ne perfektu, Pīrsona korelāciju ar MYH7 gan transkriptomikā (5.A papildattēls), gan proteomikā (5.B papildattēls). Aptuveni 25% un 33% lēno šķiedru netika klasificētas kā tīras lēnās šķiedras pēc visiem gēnu/olbaltumvielu apakštipiem transkriptomikā (5.C papildattēls) un proteomikā (5.D papildattēls). Tāpēc lēno šķiedru klasifikācija, kuras pamatā ir vairāki gēnu/olbaltumvielu apakštipi, rada papildu sarežģītību pat proteīniem, par kuriem zināms, ka tie ir specifiski šķiedru tipam. Tas liecina, ka šķiedru klasifikācija, kuras pamatā ir vienas gēnu/olbaltumvielu saimes izoformas, var nepietiekami atspoguļot skeleta muskuļu šķiedru patieso heterogenitāti.
Lai sīkāk izpētītu cilvēka skeleta muskuļu šķiedru fenotipisko mainīgumu visa omikas modeļa mērogā, mēs veicām objektīvu datu dimensiju samazināšanu, izmantojot galveno komponentu analīzi (PCA) (2.A attēls). Līdzīgi kā UMAP diagrammās, ne dalībnieks, ne testēšanas diena neietekmēja šķiedru klasterizāciju PCA līmenī (6.A–C papildattēli). Abās datu kopās MYH bāzes šķiedru tipu skaidroja PC2, kas parādīja lēnas raustīšanās 1. tipa šķiedru klasteru un otru klasteri, kas saturēja ātras raustīšanās 2A tipa, 2X tipa un jauktas 2A/2X šķiedras (2.A attēls). Abās datu kopās šos divus klasterus savienoja neliels skaits jaukta 1/2A tipa šķiedru. Kā paredzēts, galveno PC virzītājspēku pārreprezentācijas analīze apstiprināja, ka PC2 virza kontrakcijas un vielmaiņas paraksti (2.B attēls un 6.D–E papildattēli, 5.–6. papilddatu kopa). Kopumā tika konstatēts, ka uz MYH balstītais šķiedru tips ir pietiekams, lai izskaidrotu nepārtrauktas variācijas gar PC2, izņemot tā sauktās 2X šķiedras, kas bija sadalītas visā transkriptā ātrajā klasterī.
A. Transkriptomu un proteomu datu kopu galveno komponentu analīzes (PCA) diagrammas, kas iekrāsotas atbilstoši šķiedru tipam, pamatojoties uz MYH. B. Transkriptu un olbaltumvielu virzītājspēku bagātināšanas analīze PC2 un PC1. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot clusterProfiler paketi un Benjamini-Hochberg koriģētās p vērtības. C, D. PCA diagrammas, kas iekrāsotas atbilstoši starpšūnu adhēzijas gēnu ontoloģijas (GO) terminiem transkriptomā un kostamēras GO terminiem proteomā. Bultiņas attēlo transkriptu un olbaltumvielu virzītājspēkus un to virzienus. E, F. Klīniski nozīmīgu pazīmju vienotās kolektora aproksimācijas un projekcijas (UMAP) pazīmju diagrammas, kas parāda ekspresijas gradientus neatkarīgi no lēnās/ātrās šķiedru tipa. G, H. Korelācijas starp PC2 un PC1 virzītājspēkiem transkriptomās un proteomās.
Negaidīti, uz MYH balstītais miofibru tips izskaidroja tikai otro augstāko mainīguma pakāpi (PC2), kas liecina, ka citiem bioloģiskiem faktoriem, kas nav saistīti ar uz MYH balstīto miofibru tipu (PC1), ir svarīga loma skeleta muskuļu šķiedru heterogenitātes regulēšanā. Galveno PC1 virzītājspēku pārreprezentācijas analīze atklāja, ka PC1 mainīgumu galvenokārt noteica šūnu-šūnu adhēzija un ribosomu saturs transkriptomā, kā arī kostamēras un ribosomu proteīni proteomā (2.B attēls un 6.D–E papildattēli, 7. papilddatu kopa). Skeleta muskuļos kostamēras savieno Z disku ar sarkolemmu un ir iesaistītas spēka pārvadē un signalizācijā. 25 Anotēti PCA grafiki, izmantojot šūnu-šūnu adhēzijas (transkriptoms, 2.C attēls) un kostamēru (proteoms, 2.D attēls) pazīmes, atklāja spēcīgu PC1 nobīdi pa kreisi, norādot, ka šīs pazīmes ir bagātinātas noteiktās šķiedrās.
Detalizētāka miofibru klasterizācijas izpēte UMAP līmenī atklāja, ka lielākajai daļai pazīmju bija raksturīgs no miofibru tipa neatkarīgs MYH bāzes ekspresijas gradients, nevis miofibru apakšklasterim specifisks. Šī nepārtrauktība tika novērota vairākiem gēniem, kas saistīti ar patoloģiskiem stāvokļiem (2.E attēls), piemēram, CHCHD10 (neiromuskulāra slimība), SLIT3 (muskuļu atrofija), CTDNEP1 (muskuļu slimība). Šī nepārtrauktība tika novērota arī visā proteomā, tostarp olbaltumvielās, kas saistītas ar neiroloģiskiem traucējumiem (UGDH), insulīna signalizāciju (PHIP) un transkripciju (HIST1H2AB) (2.F attēls). Kopumā šie dati norāda uz nepārtrauktību šķiedru tipa neatkarīgā lēnas/ātras raustīšanās heterogenitātē dažādās miofibrās.
Interesanti, ka PC2 virzītājspēka gēni uzrādīja labu transkriptoma-proteoma korelāciju (r = 0,663) (2.G attēls), kas liecina, ka lēnas un ātras raušanās šķiedru tipi, un jo īpaši skeleta muskuļu šķiedru kontraktilās un vielmaiņas īpašības, tiek transkripcijas līmenī regulēti. Tomēr PC1 virzītājspēka gēni neuzrādīja nekādu transkriptoma-proteoma korelāciju (r = -0,027) (2.H attēls), kas liecina, ka variācijas, kas nav saistītas ar lēnas/ātras raušanās šķiedru tipiem, lielā mērā tiek regulētas pēc transkripcijas. Tā kā PC1 variācijas galvenokārt tika skaidrotas ar ribosomu gēnu ontoloģijas terminiem un ņemot vērā, ka ribosomām ir izšķiroša un specializēta loma šūnā, aktīvi piedaloties olbaltumvielu translācijā un ietekmējot to,31 mēs tālāk nolēmām izpētīt šo negaidīto ribosomu heterogenitāti.
Vispirms mēs iekrāsojām proteomikas galveno komponentu analīzes grafiku atbilstoši olbaltumvielu relatīvajam daudzumam GOCC terminā “citoplazmatiskā ribosoma” (3.A attēls). Lai gan šis termins ir bagātināts PC1 pozitīvajā pusē, kā rezultātā rodas neliels gradients, ribosomu proteīni veicina sadalīšanos abos PC1 virzienos (3.A attēls). Ribosomu proteīni, kas bagātināti PC1 negatīvajā pusē, ietvēra RPL18, RPS18 un RPS13 (3.B attēls), savukārt RPL31, RPL35 un RPL38 (3.C attēls) bija galvenie PC1 pozitīvās puses virzītājspēki. Interesanti, ka RPL38 un RPS13 bija ļoti ekspresēti skeleta muskuļos, salīdzinot ar citiem audiem (7.A papildattēls). Šīs atšķirīgās ribosomu pazīmes PC1 transkriptā netika novērotas (7.B papildattēls), kas norāda uz posttranskripcijas regulāciju.
A. Galveno komponentu analīzes (PCA) diagramma, kas iekrāsota atbilstoši citoplazmatisko ribosomu gēnu ontoloģijas (GO) terminiem visā proteomā. Bultiņas norāda olbaltumvielu mediētās variācijas virzienu PCA diagrammā. Līnijas garums atbilst dotā proteīna galveno komponentu vērtējumam. B, C. PCA pazīmju diagrammas RPS13 un RPL38. D. Citoplazmatisko ribosomu olbaltumvielu nekontrolēta hierarhiska klasterizācijas analīze. E. 80S ribosomas strukturālais modelis (PDB: 4V6X), kas izceļ ribosomu proteīnus ar atšķirīgu daudzumu skeleta muskuļu šķiedrās. F. Ribosomu proteīni ar atšķirīgu stehiometriju, kas lokalizēti mRNS izejas kanāla tuvumā.
Ribosomu heterogenitātes un specializācijas koncepcijas ir ierosinātas iepriekš, saskaņā ar kurām atšķirīgu ribosomu apakšpopulāciju klātbūtne (ribosomu heterogenitāte) var tieši ietekmēt olbaltumvielu translāciju dažādos audos32 un šūnās33, izmantojot specifisku mRNS transkriptu kopu34 selektīvu translāciju (ribosomu specializācija). Lai identificētu ribosomu olbaltumvielu apakšpopulācijas, kas tiek koekspresētas skeleta muskuļu šķiedrās, mēs veicām nekontrolētu ribosomu olbaltumvielu hierarhisku klasterizācijas analīzi proteomā (3D attēls, 8. papildu datu kopa). Kā paredzēts, ribosomu olbaltumvielas negrupējās pēc šķiedru veida, pamatojoties uz MYH. Tomēr mēs identificējām trīs atšķirīgus ribosomu olbaltumvielu klasterus; pirmais klasteris (ribosomu_klasteris_1) tiek koregulēts ar RPL38, un tāpēc tam ir palielināta ekspresija šķiedrās ar pozitīvu PC1 profilu. Otrais klasteris (ribosomu_klasteris_2) tiek koregulēts ar RPS13, un tā līmenis ir paaugstināts šķiedrās ar negatīvu PC1 profilu. Trešais klasteris (ribosomu_klasteris_3) neuzrāda koordinētu diferenciālu ekspresiju skeleta muskuļu šķiedrās un to var uzskatīt par skeleta muskuļu ribosomu olbaltumvielu “kodolu”. Gan ribosomu 1., gan 2. klasteris satur ribosomu proteīnus, par kuriem iepriekš ir pierādīts, ka tie regulē alternatīvo translāciju (piemēram, RPL10A, RPL38, RPS19 un RPS25) un funkcionāli ietekmē attīstību (piemēram, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Saskaņā ar PCA rezultātiem, novērotā šo ribosomu proteīnu heterogēnā reprezentācija pāri šķiedrām arī parādīja nepārtrauktību (7.C papildattēls).
Lai vizualizētu heterogēno ribosomu olbaltumvielu atrašanās vietu ribosomā, mēs izmantojām cilvēka 80S ribosomas strukturālo modeli (Protein Data Bank: 4V6X) (3.E attēls). Pēc ribosomu olbaltumvielu izolēšanas, kas pieder pie dažādiem ribosomu klasteriem, to atrašanās vietas nebija cieši saskaņotas, kas liecina, ka mūsu pieeja nespēja nodrošināt bagātināšanu noteiktiem ribosomas reģioniem/frakcijām. Interesanti, ka lielo apakšvienību olbaltumvielu īpatsvars 2. klasterī bija mazāks nekā 1. un 3. klasterī (7.D papildattēls). Mēs novērojām, ka olbaltumvielas ar izmainītu stehiometriju skeleta muskuļu šķiedrās galvenokārt bija lokalizētas ribosomu virsmā (3.E attēls), kas atbilst to spējai mijiedarboties ar iekšējās ribosomu ieejas vietas (IRES) elementiem dažādās mRNS populācijās, tādējādi koordinējot selektīvu translāciju.40, 41 Turklāt daudzi olbaltumvielas ar izmainītu stehiometriju skeleta muskuļu šķiedrās atradās funkcionālo reģionu, piemēram, mRNS izejas tuneļa (3.F attēls), tuvumā, kas selektīvi regulē specifisku peptīdu translācijas pagarināšanos un apstāšanos. 42 Rezumējot, mūsu dati liecina, ka skeleta muskuļu ribosomu olbaltumvielu stehiometrija uzrāda heterogenitāti, kā rezultātā rodas atšķirības starp skeleta muskuļu šķiedrām.
Tālāk mēs nolēmām identificēt ātras un lēnas raušanās šķiedru parakstus un izpētīt to transkripcijas regulācijas mehānismus. Salīdzinot ātras un lēnas raušanās šķiedru klasterus, ko UMAP definēja divos datu kopumos (1.G–H un 4.A–B attēli), transkriptomiskās un proteomiskās analīzes identificēja attiecīgi 1366 un 804 atšķirīgi bagātīgas pazīmes (4.A–B attēls, 9.–12. papildu datu kopa). Mēs novērojām paredzētās atšķirības parakstos, kas saistīti ar sarkomēriem (piemēram, tropomiozīnu un troponīnu), ierosmes-kontrakcijas savienojumu (SERCA izoformas) un enerģijas metabolismu (piemēram, ALDOA un CKB). Turklāt transkripti un proteīni, kas regulē proteīnu ubikvitināciju, tika diferencēti ekspresēti ātras un lēnas raušanās šķiedrās (piemēram, USP54, SH3RF2, USP28 un USP48) (4.A–B attēls). Turklāt mikrobiālā proteīna gēns RP11-451G4.2 (DWORF), par kuru iepriekš ir pierādīts, ka tas atšķirīgi ekspresējas dažādos jēra muskuļu šķiedru tipos43 un pastiprina SERCA aktivitāti sirds muskulī44, tika ievērojami paaugstināts lēnajās skeleta muskuļu šķiedrās (4.A attēls). Līdzīgi atsevišķu šķiedru līmenī tika novērotas būtiskas atšķirības zināmos parakstos, piemēram, ar metabolismu saistītās laktātdehidrogenāzes izoformās (LDHA un LDHB, 4.C attēls un 8.A papildattēls)45,46, kā arī iepriekš nezināmos šķiedru tipa specifiskos parakstos (piemēram, IRX3, USP54, USP28 un DPYSL3) (4.C attēls). Bija ievērojama diferencēti ekspresēto pazīmju pārklāšanās starp transkriptomiskajiem un proteomikas datu kopumiem (8.B papildattēls), kā arī reizes izmaiņu korelācija, ko galvenokārt noteica izteiktāka sarkomēru pazīmju diferenciālā ekspresija (8.C papildattēls). Jāatzīmē, ka daži paraksti (piemēram, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) uzrādīja spēcīgu pēctranskripcijas regulāciju tikai proteomikas līmenī un tiem bija lēni/ātri raustīšanās šķiedru tipam raksturīgi ekspresijas profili (8.C papildinājums).
A un B vulkānu diagrammas, kurās salīdzināti lēnie un ātrie klasteri, kas identificēti ar vienotās kolektora aproksimācijas un projekcijas (UMAP) diagrammām 1.G–H attēlos. Krāsainie punkti apzīmē transkriptus vai proteīnus, kas būtiski atšķiras pie FDR < 0,05, un tumšāki punkti apzīmē transkriptus vai proteīnus, kas būtiski atšķiras pie logaritmiskās izmaiņas > 1. Divvirzienu statistiskā analīze tika veikta, izmantojot DESeq2 Wald testu ar Benjamini-Hohberga koriģētām p vērtībām (transkriptomika) vai Limmas lineārā modeļa metodi ar empīrisku Bajesa analīzi, kam sekoja Benjamini-Hohberga korekcija vairākkārtējai salīdzināšanai (proteomika). C Atlasīto diferencēti ekspresēto gēnu vai proteīnu signatūru diagrammas starp lēnajām un ātrajām šķiedrām. D Būtiski diferencēti ekspresēto transkriptu un proteīnu bagātināšanas analīze. Pārklājošās vērtības ir bagātinātas abos datu kopās, transkriptoma vērtības ir bagātinātas tikai transkriptomā, un proteoma vērtības ir bagātinātas tikai proteomā. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot clusterProfiler paketi ar Benjamini-Hohberga koriģētām p vērtībām. E. Ar SCENIC identificēti šķiedru tipam specifiski transkripcijas faktori, pamatojoties uz ar SCENIC atvasinātajiem regulatoru specifiskuma rādītājiem un atšķirīgo mRNS ekspresiju starp šķiedru tipiem. F. Izvēlēto transkripcijas faktoru profilēšana, kas atšķirīgi ekspresējas starp lēnajām un ātrajām šķiedrām.
Pēc tam mēs veicām atšķirīgi pārstāvēto gēnu un olbaltumvielu pārreprezentācijas analīzi (4.D attēls, 13. papilddatu kopa). Ceļu bagātināšana pazīmēm, kas atšķīrās starp abām datu kopām, atklāja paredzētās atšķirības, piemēram, taukskābju β-oksidācijas un ketonu metabolisma procesus (lēnās šķiedras), miofilamentu/muskuļu kontrakciju (attiecīgi ātrās un lēnās šķiedras) un ogļhidrātu kataboliskos procesus (ātrās šķiedras). Serīna/treonīna olbaltumvielu fosfatāzes aktivitāte bija paaugstināta arī ātrajās šķiedrās, ko noteica tādas pazīmes kā regulējošās un katalītiskās fosfatāzes apakšvienības (PPP3CB, PPP1R3D un PPP1R3A), kas, kā zināms, regulē glikogēna metabolismu (47) (8.D–E papildattēli). Citi ceļi, kas bagātināti ar ātrajām šķiedrām, ietvēra apstrādes (P-) ķermeņus (YTHDF3, TRIM21, LSM2) proteomā (8.F papildattēls), kas potenciāli ir iesaistīti pēctranskripcijas regulācijā (48), un transkripcijas faktoru aktivitāti (SREBF1, RXRG, RORA) transkriptomā (8.G papildattēls). Lēnās šķiedras tika bagātinātas ar oksidoreduktāzes aktivitāti (BDH1, DCXR, TXN2) (8.H papildinājums), amīda saistīšanos (CPTP, PFDN2, CRYAB) (8.I papildinājums), ārpusšūnu matricu (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (8.J papildinājums) un receptoru-ligandu aktivitāti (FNDC5, SPX, NENF) (8.K papildinājums).
Lai iegūtu dziļāku ieskatu transkripcijas regulācijā, kas ir lēno/ātro muskuļu šķiedru tipa raksturlielumu pamatā, mēs veicām transkripcijas faktoru bagātināšanas analīzi, izmantojot SCENIC49 (14. papilddatu kopa). Daudzi transkripcijas faktori bija ievērojami bagātināti starp ātrajām un lēnajām muskuļu šķiedrām (4.E attēls). Tas ietvēra tādus transkripcijas faktorus kā MAFA, kas iepriekš ir saistīts ar ātro muskuļu šķiedru attīstību,50 kā arī vairākus transkripcijas faktorus, kas iepriekš nebija saistīti ar muskuļu šķiedru tipam specifiskām gēnu programmām. Starp tiem PITX1, EGR1 un MYF6 bija visvairāk bagātinātie transkripcijas faktori ātrajās muskuļu šķiedrās (4.E attēls). Turpretī ZSCAN30 un EPAS1 (pazīstams arī kā HIF2A) bija visvairāk bagātinātie transkripcijas faktori lēnajās muskuļu šķiedrās (4.E attēls). Atbilstoši tam MAFA tika ekspresēts augstākā līmenī UMAP reģionā, kas atbilst ātrajām muskuļu šķiedrām, savukārt EPAS1 bija pretējs ekspresijas modelis (4.F attēls).
Papildus zināmajiem proteīnus kodējošajiem gēniem ir arī daudzi nekodējoši RNS biotipi, kas varētu būt iesaistīti cilvēka attīstības un slimību regulēšanā.51, 52 Transkriptomu datu kopās vairākām nekodējošām RNS piemīt šķiedru tipa specifiskums (5.A attēls un 15. papilddatu kopa), tostarp LINC01405, kas ir ļoti specifiska lēnajām šķiedrām un par kuras samazināšanos ziņots muskuļu šūnās pacientiem ar mitohondriju miopātiju.53 Turpretī RP11-255P5.3, kas atbilst lnc-ERCC5-5 gēnam (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, piemīt ātro šķiedru tipa specifiskums. Gan LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), gan RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) uzrāda skeleta muskuļu specifiskumu (9.A–B papildattēli), un to 1 Mb genoma apkārtnē nav zināmu kontraktilo gēnu, kas liecina, ka tiem ir specializēta loma šķiedru tipu regulēšanā, nevis blakus esošo kontraktilo gēnu regulēšanā. LINC01405 un RP11-255P5.3 lēnās/ātrās šķiedru tipam raksturīgie ekspresijas profili tika apstiprināti, izmantojot RNAscope (5.B–C attēls).
A. Nekodējošie RNS transkripti ir būtiski regulēti lēnās un ātrās raušanās muskuļu šķiedrās. B. Reprezentatīvi RNAscope attēli, kas parāda attiecīgi LINC01405 un RP11-255P5.3 lēnās un ātrās raušanās šķiedru tipa specifiskumu. Mēroga josla = 50 μm. C. Miofibru tipam specifiskās nekodējošās RNS ekspresijas kvantitatīva noteikšana, kas noteikta ar RNAscope (n = 3 biopsijas no neatkarīgiem indivīdiem, salīdzinot ātrās un lēnās muskuļu šķiedras katrā indivīdā). Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot divpusēju Stjudenta t-testu. Kārbu diagrammas parāda mediānu, pirmo un trešo kvartili, un ūsas norāda uz minimālajām un maksimālajām vērtībām. D. De novo mikrobu proteīnu identifikācijas darbplūsma (izveidota ar BioRender.com). E. Mikrobu proteīns LINC01405_ORF408:17441:17358 tiek specifiski ekspresēts lēnās skeleta muskuļu šķiedrās (n = 5 biopsijas no neatkarīgiem dalībniekiem, salīdzinot ātrās un lēnās muskuļu šķiedras katrā dalībniekā). Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot Limma lineārā modeļa metodi apvienojumā ar empīrisku Bajesa pieeju, kam sekoja Benjamini-Hohberga metode vairāku salīdzinājumu veikšanai ar p-vērtības korekciju. Kastīšu diagrammas parāda mediānu, pirmo un trešo kvartili, un ūsas norāda uz maksimālajām/minimālajām vērtībām.
Nesen veikti pētījumi ir parādījuši, ka daudzi iespējamie nekodējošie transkripti kodē transkribētus mikrobu proteīnus, no kuriem daži regulē muskuļu funkciju.44, 55 Lai identificētu mikrobu proteīnus ar potenciālu šķiedru tipa specifiskumu, mēs meklējām mūsu 1000 šķiedru proteomu datu kopā, izmantojot pielāgotu FASTA failu, kas satur nekodējošo transkriptu secības (n = 305), kas atrodamas 1000 šķiedru transkriptomu datu kopā (5.D attēls). Mēs identificējām 197 mikrobu proteīnus no 22 dažādiem transkriptiem, no kuriem 71 bija atšķirīgi regulēts starp lēnajām un ātrajām skeleta muskuļu šķiedrām (9.C papildattēls un 16. papilddatu kopa). LINC01405 tika identificēti trīs mikrobu proteīnu produkti, no kuriem viens uzrādīja līdzīgu lēno šķiedru specifiskumu kā tā transkripts (5.E attēls un 9.D papildattēls). Tādējādi mēs identificējām LINC01405 kā gēnu, kas kodē mikrobu proteīnu, kas specifisks lēnajām skeleta muskuļu šķiedrām.
Mēs izstrādājām visaptverošu darbplūsmu atsevišķu muskuļu šķiedru liela mēroga proteomikas raksturošanai un identificējām šķiedru heterogenitātes regulatorus veselos stāvokļos. Mēs izmantojām šo darbplūsmu, lai izprastu, kā nemalīna miopātijas ietekmē skeleta muskuļu šķiedru heterogenitāti. Nemalīna miopātijas ir iedzimtas muskuļu slimības, kas izraisa muskuļu vājumu un skartajiem bērniem izpaužas ar dažādām komplikācijām, tostarp elpošanas distresu, skoliozi un ierobežotu ekstremitāšu kustīgumu.19,20 Parasti nemalīna miopātiju gadījumā patogēni varianti tādos gēnos kā aktīna alfa 1 (ACTA1) izraisa lēnas raustīšanās šķiedru miofibru sastāva pārsvaru, lai gan šis efekts ir heterogēns. Viens ievērojams izņēmums ir troponīna T1 nemalīna miopātija (TNNT1), kurai pārsvarā ir ātrās šķiedras. Tādējādi labāka izpratne par heterogenitāti, kas ir pamatā skeleta muskuļu šķiedru disregulācijai, kas novērota nemalīna miopātijās, var palīdzēt atšķetināt sarežģīto saistību starp šīm slimībām un miofibru tipu.
Salīdzinot ar veseliem kontroles subjektiem (n = 3 katrā grupā), miofibrās, kas izolētas no nemalīna miopātijas pacientiem ar mutācijām ACTA1 un TNNT1 gēnos, tika novērota izteikta miofibru atrofija vai distrofija (6.A attēls, 3. papildtabula). Tas radīja ievērojamas tehniskas problēmas proteomikas analīzei ierobežotā pieejamā materiāla daudzuma dēļ. Neskatoties uz to, mēs varējām noteikt 2485 proteīnus 272 skeleta miofibrās. Pēc filtrēšanas, lai noteiktu vismaz 1000 kvantitatīvi noteiktus proteīnus katrā šķiedrā, 250 šķiedras tika pakļautas turpmākai bioinformātikas analīzei. Pēc filtrēšanas vidēji tika kvantitatīvi noteikti 1573 ± 359 proteīni katrā šķiedrā (10.A papildattēls, 17.–18. papildu datu kopa). Jāatzīmē, ka, neskatoties uz ievērojamo šķiedru izmēra samazināšanos, nemalīna miopātijas pacientu paraugu proteomu dziļums samazinājās tikai nedaudz. Turklāt šo datu apstrāde, izmantojot mūsu pašu FASTA failus (tostarp nekodējošus transkriptus), ļāva mums identificēt piecus mikrobu proteīnus nemalīna miopātijas pacientu skeleta miofibros (19. papilddatu kopa). Proteoma dinamiskais diapazons bija ievērojami plašāks, un kopējais proteīnu daudzums kontroles grupā labi korelēja ar iepriekšējās 1000 šķiedru proteomu analīzes rezultātiem (10.B–C. papildattēls).
A. Mikroskopiski attēli, kuros redzama šķiedru atrofija vai distrofija un dažādu šķiedru tipu pārsvars, pamatojoties uz MYH, ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijās (NM). Mēroga josla = 100 μm. Lai nodrošinātu krāsošanas reproducējamību ACTA1 un TNNT1 pacientiem, trīs pacientu biopsijas tika iekrāsotas divas līdz trīs reizes (četras sekcijas katrā gadījumā), pirms tika atlasīti reprezentatīvi attēli. B. Šķiedru tipu proporcijas dalībniekiem, pamatojoties uz MYH. C. Skeleta muskuļu šķiedru galveno komponentu analīzes (PCA) diagramma pacientiem ar nemalīna miopātijām un kontroles grupai. D. Skeleta muskuļu šķiedras no pacientiem ar nemalīna miopātijām un kontroles grupas, projicētas PCA diagrammā, kas noteikta no 1000 analizētajām šķiedrām 2. attēlā. Piemēram, vulkāna diagrammas, kurās salīdzinātas atšķirības starp dalībniekiem ar ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijām un kontroles grupu, kā arī starp dalībniekiem ar ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijām. Krāsainie apļi apzīmē olbaltumvielas, kas bija būtiski atšķirīgas pie π < 0,05, un tumšie punkti apzīmē olbaltumvielas, kas bija būtiski atšķirīgas pie FDR < 0,05. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot Limmas lineārā modeļa metodi un empīriskās Bajesa metodes, kam sekoja p-vērtības korekcija vairākiem salīdzinājumiem, izmantojot Benjamini-Hohberga metodi. H. Būtiski atšķirīgi ekspresēto olbaltumvielu bagātināšanas analīze visā proteomā un 1. un 2A tipa šķiedrās. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot clusterProfiler paketi un Benjamini-Hohberga koriģētās p-vērtības. I, J. Galveno komponentu analīzes (PCA) diagrammas, kas iekrāsotas ar ārpusšūnu matricas un mitohondriju gēnu ontoloģijas (GO) terminiem.
Tā kā nemalīna miopātijas var ietekmēt MYH ekspresējošo miofibru tipu īpatsvaru skeleta muskuļos,19,20 mēs vispirms pārbaudījām MYH ekspresējošos miofibru tipus pacientiem ar nemalīna miopātijām un kontroles grupā. Mēs noteicām miofibru tipu, izmantojot objektīvu metodi, kas iepriekš aprakstīta 1000 miofibru testam (10.D–E papildattēls), un atkal neizdevās identificēt tīras 2X miofibras (6.B attēls). Mēs novērojām nemalīna miopātiju heterogēnu ietekmi uz miofibru tipu, jo diviem pacientiem ar ACTA1 mutācijām bija palielināta 1. tipa miofibru proporcija, savukārt diviem pacientiem ar TNNT1 nemalīna miopātiju bija samazināta 1. tipa miofibru proporcija (6.B attēls). Patiešām, MYH2 un ātro troponīna izoformu (TNNC2, TNNI2 un TNNT3) ekspresija bija samazināta ACTA1-nemalīna miopātiju gadījumā, savukārt MYH7 ekspresija bija samazināta TNNT1-nemalīna miopātiju gadījumā (11.A papildattēls). Tas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem par heterogēnu miofibru tipa maiņu nemalīna miopātiju gadījumā.19,20 Mēs apstiprinājām šos rezultātus ar imūnhistoķīmiju un atklājām, ka pacientiem ar ACTA1-nemalīna miopātiju bija 1. tipa miofibru pārsvars, savukārt pacientiem ar TNNT1-nemalīna miopātiju bija pretējs modelis (6.A attēls).
Vienas šķiedras proteomu līmenī skeleta muskuļu šķiedras no ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijas pacientiem grupējās kopā ar lielāko daļu kontroles šķiedru, un TNNT1 nemalīna miopātijas šķiedras parasti bija visnopietnāk skartas (6.C attēls). Tas bija īpaši acīmredzams, katram pacientam uzzīmējot pseidoinflatētu šķiedru galveno komponentu analīzes (PCA) diagrammas, kur TNNT1 nemalīna miopātijas pacienti 2 un 3 šķita vistālāk no kontroles paraugiem (11.B papildattēls, 20. papilddatu kopa). Lai labāk izprastu, kā miopātijas pacientu šķiedras salīdzināmas ar veselām šķiedrām, mēs izmantojām detalizētu informāciju, kas iegūta no 1000 šķiedru proteomikas analīzes no veseliem pieaugušiem dalībniekiem. Mēs projicējām šķiedras no miopātijas datu kopas (ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijas pacienti un kontroles grupa) uz PCA diagrammu, kas iegūta no 1000 šķiedru proteomikas analīzes (6.D attēls). MYH šķiedru tipu sadalījums gar PC2 kontroles šķiedrās bija līdzīgs šķiedru sadalījumam, kas iegūts no 1000 šķiedru proteomikas analīzes. Tomēr lielākā daļa šķiedru nemalīna miopātijas pacientiem nobīdījās uz leju PC2 virzienā, pārklājoties ar veselām ātrās saraušanās šķiedrām, neatkarīgi no to dabiskā MYH šķiedru tipa. Tādējādi, lai gan pacientiem ar ACTA1 nemalīna miopātiju, kvantitatīvi nosakot ar MYH metodēm, tika novērota nobīde 1. tipa šķiedru virzienā, gan ACTA1 nemalīna miopātija, gan TNNT1 nemalīna miopātija nobīdīja skeleta muskuļu šķiedru proteomu ātrās saraušanās šķiedru virzienā.
Pēc tam mēs tieši salīdzinājām katru pacientu grupu ar veseliem kontroles subjektiem un identificējām attiecīgi 256 un 552 atšķirīgi ekspresētus proteīnus ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijās (6.E–G attēls un 11.C papildattēls, 21. papilddatu kopa). Gēnu bagātināšanas analīze atklāja koordinētu mitohondriju proteīnu samazināšanos (6.H–I attēls, 22. papilddatu kopa). Pārsteidzoši, ka, neskatoties uz šķiedru tipu atšķirīgo pārsvaru ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijās, šis samazinājums bija pilnīgi neatkarīgs no MYH bāzes šķiedru tipa (6.H attēls un 11.D–I papildattēls, 23. papilddatu kopa). ACTA1 vai TNNT1 nemalīna miopātijās tika regulēti arī trīs mikrobu proteīni. Divi no šiem mikroproteīniem, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (pazīstams arī kā LINC00598 vai Lnc-FOXO1) un ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), uzrādīja atšķirīgu daudzumu tikai 1. tipa miofibrās. Iepriekš ir ziņots, ka ENSG00000215483_TR14_ORF67 ir saistīta ar šūnu cikla regulāciju.56 No otras puses, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (atbilst LINC01798) bija palielināts gan 1., gan 2A tipa miofibrās ACTA1-nemalīna miopātijas gadījumā, salīdzinot ar veseliem kontroles subjektiem (12.A papildattēls, 24. papilddatu kopa). Turpretī ribosomu olbaltumvielas lielā mērā neietekmēja nemalīna miopātija, lai gan RPS17 tika samazināts ACTA1 nemalīna miopātijā (6.E attēls).
Bagātināšanas analīze atklāja arī imūnsistēmas procesu pastiprinātu regulāciju ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijās, savukārt šūnu adhēzija bija palielināta arī TNNT1 nemalīna miopātijā (6.H attēls). Šo ekstracelulāro faktoru bagātināšanos atspoguļoja ekstracelulārās matrices proteīni, kas nobīdīja PCA PC1 un PC2 negatīvā virzienā (t.i., pret visvairāk skartajām šķiedrām) (6.J attēls). Abās pacientu grupās tika novērota pastiprināta ekstracelulāro proteīnu, kas iesaistīti imūnreakcijās un sarkolemmas atjaunošanas mehānismos, ekspresija, piemēram, aneksīni (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 un to mijiedarbojošais proteīns S100A1159 (12.B–C papildattēli). Iepriekš ir ziņots, ka šis process ir pastiprināts muskuļu distrofijās60, bet, cik mums zināms, tas iepriekš nav bijis saistīts ar nemalīna miopātijām. Šī molekulārā mehānisma normāla funkcija ir nepieciešama sarkolemmas atjaunošanai pēc traumas un jaunizveidoto miocītu saplūšanai ar miofibriem58,61. Tādējādi šī procesa pastiprinātā aktivitāte abās pacientu grupās liecina par reparatīvu reakciju uz miofibru nestabilitātes izraisītu traumu.
Katras nemalīna miopātijas ietekme bija labi korelēta (r = 0,736) un uzrādīja saprātīgu pārklāšanos (11.A–B papildattēli), norādot, ka ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijai ir līdzīga ietekme uz proteomu. Tomēr daži proteīni tika regulēti tikai ACTA1 vai TNNT1 nemalīna miopātijā (11.A un C papildattēli). Profibrotiskais proteīns MFAP4 bija viens no visvairāk regulētajiem proteīniem TNNT1 nemalīna miopātijā, bet ACTA1 nemalīna miopātijā tas palika nemainīgs. SKIC8, PAF1C kompleksa sastāvdaļa, kas atbild par HOX gēna transkripcijas regulēšanu, tika samazināta TNNT1 nemalīna miopātijā, bet ACTA1 nemalīna miopātijā tas netika ietekmēts (11.A papildattēls). Tiešs ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijas salīdzinājums atklāja lielāku mitohondriju olbaltumvielu samazināšanos un imūnsistēmas olbaltumvielu palielināšanos TNNT1 nemalīna miopātijā (6.G–H attēls un 11.C un 11.H–I papildattēli). Šie dati atbilst lielākai atrofijai/distrofijai, kas novērota TNNT1 nemalīna miopātijā, salīdzinot ar TNNT1 nemalīna miopātiju (6.A attēls), kas liecina, ka TNNT1 nemalīna miopātija ir smagāka slimības forma.
Lai novērtētu, vai novērotā nemalīna miopātijas ietekme saglabājas visa muskuļa līmenī, mēs veicām muskuļu biopsiju masveida proteomikas analīzi no vienas un tās pašas TNNT1 nemalīna miopātijas pacientu kohortas un salīdzinājām tās ar kontroles grupu (n = 3 katrā grupā) (13.A papildattēls, 25. papilddatu kopa). Kā paredzēts, kontroles grupa bija cieši saistīta galveno komponentu analīzē, savukārt TNNT1 nemalīna miopātijas pacientiem bija lielāka starpparaugu mainība, kas līdzīga tai, kas novērota atsevišķu šķiedru analīzē (13.B papildattēls). Masveida analīze reproducēja atšķirīgi ekspresētos proteīnus (13.C papildattēls, 26. papilddatu kopa) un bioloģiskos procesus (13.D papildattēls, 27. papilddatu kopa), kas tika izcelti, salīdzinot atsevišķas šķiedras, bet zaudēja spēju atšķirt dažādus šķiedru veidus un neizdevās ņemt vērā neviendabīgu slimības ietekmi uz dažādām šķiedrām.
Kopumā šie dati parāda, ka vienas miofibras proteomika var izskaidrot klīniski bioloģiskās pazīmes, kuras nevar noteikt ar mērķtiecīgām metodēm, piemēram, imūnblotēšanu. Turklāt šie dati izceļ aktīna šķiedru tipizācijas (MYH) izmantošanas ierobežojumus, lai aprakstītu fenotipisko adaptāciju. Patiešām, lai gan šķiedru tipa maiņa atšķiras starp aktīna un troponīna nemalīna miopātijām, abas nemalīna miopātijas atdala MYH šķiedru tipizāciju no skeleta muskuļu šķiedru metabolisma, virzoties uz ātrāku un mazāk oksidatīvu muskuļu proteomu.
Šūnu heterogenitāte ir kritiski svarīga, lai audi varētu apmierināt savas daudzveidīgās prasības. Skeleta muskuļos to bieži raksturo kā šķiedru tipus, kam raksturīga atšķirīga spēka radīšanas pakāpe un noguruma spēja. Tomēr ir skaidrs, ka tas izskaidro tikai nelielu daļu no skeleta muskuļu šķiedru mainīguma, kas ir daudz mainīgāka, sarežģītāka un daudzšķautņaināka nekā iepriekš uzskatīts. Tehnoloģiju attīstība tagad ir izgaismojusi faktorus, kas regulē skeleta muskuļu šķiedras. Patiešām, mūsu dati liecina, ka 2X tipa šķiedras, iespējams, nav atsevišķs skeleta muskuļu šķiedru apakštips. Turklāt mēs identificējām vielmaiņas proteīnus, ribosomu proteīnus un ar šūnām saistītus proteīnus kā galvenos skeleta muskuļu šķiedru heterogenitātes noteicošos faktorus. Pielietojot mūsu proteomikas darbplūsmu pacientu paraugiem ar nematodu miopātiju, mēs vēl vairāk pierādījām, ka uz MYH balstīta šķiedru tipizēšana pilnībā neatspoguļo skeleta muskuļu heterogenitāti, īpaši, ja sistēma ir traucēta. Patiešām, neatkarīgi no uz MYH balstīta šķiedru tipa, nematodu miopātija izraisa pāreju uz ātrākām un mazāk oksidatīvām šķiedrām.
Skeleta muskuļu šķiedras tiek klasificētas kopš 19. gadsimta. Jaunākās omikas analīzes ir ļāvušas mums sākt izprast dažādu MYH šķiedru tipu ekspresijas profilus un to reakcijas uz dažādiem stimuliem. Kā aprakstīts šeit, omikas pieejām ir arī tāda priekšrocība kā lielāka jutība šķiedru tipu marķieru kvantitatīvā noteikšanā nekā tradicionālajām uz antivielām balstītajām metodēm, nepaļaujoties uz viena (vai dažu) marķieru kvantitatīvu noteikšanu skeleta muskuļu šķiedru tipa definēšanai. Mēs izmantojām komplementāras transkriptomikas un proteomikas darbplūsmas un integrējām rezultātus, lai pārbaudītu šķiedru heterogenitātes transkripcijas un posttranskripcijas regulāciju cilvēka skeleta muskuļu šķiedrās. Šīs darbplūsmas rezultātā neizdevās identificēt tīras 2X tipa šķiedras olbaltumvielu līmenī mūsu veselo jauno vīriešu kohortas vastus lateralis muskulī. Tas atbilst iepriekšējiem vienas šķiedras pētījumiem, kuros veselos vastus lateralis muskuļos tika konstatēts <1% tīru 2X šķiedru, lai gan tas nākotnē būtu jāapstiprina citos muskuļos. Neatbilstība starp gandrīz tīru 2X šķiedru noteikšanu mRNS līmenī un tikai jauktu 2A/2X šķiedru noteikšanu olbaltumvielu līmenī ir mulsinoša. MYH izoformas mRNS ekspresija nav diennakts ritms,67 kas liecina, ka, visticamāk, mēs neesam "palaiduši garām" MYH2 sākuma signālu šķietami tīrās 2X šķiedrās RNS līmenī. Viens no iespējamiem skaidrojumiem, lai gan tīri hipotētisks, varētu būt atšķirības olbaltumvielu un/vai mRNS stabilitātē starp MYH izoformām. Patiešām, neviena ātrā šķiedra nav 100% tīra nevienai MYH izoformai, un nav skaidrs, vai MYH1 mRNS ekspresijas līmenis 70–90% diapazonā nodrošinātu vienādu MYH1 un MYH2 pārpilnību olbaltumvielu līmenī. Tomēr, apsverot visu transkriptomu vai proteomu, klasteru analīze var pārliecinoši identificēt tikai divus atšķirīgus klasterus, kas pārstāv lēnas un ātras skeleta muskuļu šķiedras, neatkarīgi no to precīzā MYH sastāva. Tas atbilst analīzēm, kurās izmantotas viena kodola transkriptomikas pieejas, kas parasti identificē tikai divus atšķirīgus mionukleāros klasterus.68, 69, 70 Turklāt, lai gan iepriekšējos proteomikas pētījumos ir identificētas 2X tipa šķiedras, šīs šķiedras neveido klasterus atsevišķi no pārējām ātrajām šķiedrām un uzrāda tikai nelielu skaitu atšķirīgi bagātīgu olbaltumvielu salīdzinājumā ar citiem šķiedru tipiem, kuru pamatā ir MYH. 14 Šie rezultāti liek domāt, ka mums vajadzētu atgriezties pie 20. gadsimta sākuma muskuļu šķiedru klasifikācijas uzskata, kas cilvēka skeleta muskuļu šķiedras iedalīja nevis trīs atšķirīgās klasēs, pamatojoties uz MYH, bet gan divos klasteros, pamatojoties uz to vielmaiņas un kontrakcijas īpašībām. 63
Vēl svarīgāk ir tas, ka miofibru heterogenitāte jāapsver vairākos aspektos. Iepriekšējie "-omikas" pētījumi ir norādījuši uz šo virzienu, liekot domāt, ka skeleta muskuļu šķiedras neveido atsevišķus klasterus, bet gan ir izvietotas nepārtraukti. 11, 13, 14, 64, 71 Šeit mēs parādām, ka papildus skeleta muskuļu kontrakcijas un vielmaiņas īpašību atšķirībām miofibras var diferencēt pēc pazīmēm, kas saistītas ar šūnu-šūnu mijiedarbību un translācijas mehānismiem. Patiešām, mēs atklājām ribosomu heterogenitāti skeleta muskuļu šķiedrās, kas veicina heterogenitāti neatkarīgi no lēno un ātro šķiedru tipiem. Šīs ievērojamās miofibru heterogenitātes pamatcēlonis, kas nav atkarīgs no lēno un ātro šķiedru tipa, joprojām nav skaidrs, taču tas var norādīt uz specializētu telpisko organizāciju muskuļu saišķos, kas optimāli reaģē uz specifiskiem spēkiem un slodzēm,72 specializētu šūnu vai orgānu specifisku komunikāciju ar citiem šūnu tipiem muskuļu mikrovidē73,74,75 vai ribosomu aktivitātes atšķirībām atsevišķās miofibrās. Patiešām, ir pierādīts, ka ribosomu heteroplazmija, vai nu ar RPL3 un RPL3L paralogu aizvietošanu, vai rRNS 2′O-metilēšanas līmenī, ir saistīta ar skeleta muskuļu hipertrofiju . Multi-omikas un telpiskas pielietošanas apvienojumā ar atsevišķu miofibru funkcionālo raksturojumu vēl vairāk uzlabos mūsu izpratni par muskuļu bioloģiju multi-omikas līmenī .
Analizējot atsevišķu miofibru proteomas no pacientiem ar nemalīna miopātijām, mēs arī pierādījām atsevišķu miofibru proteomikas lietderību, efektivitāti un piemērojamību skeleta muskuļu klīniskās patofizioloģijas noskaidrošanā. Turklāt, salīdzinot mūsu darbplūsmu ar globālo proteomikas analīzi, mēs varējām pierādīt, ka atsevišķu miofibru proteomika sniedz tādu pašu informācijas dziļumu kā globālā audu proteomika un paplašina šo dziļumu, ņemot vērā starpšķiedru heterogenitāti un miofibru tipu. Papildus paredzamajām (lai gan mainīgajām) atšķirībām šķiedru tipu attiecībās, kas novērotas ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātiju gadījumā, salīdzinot ar veseliem kontroles subjektiem,19 mēs arī novērojām oksidatīvo un ekstracelulāro remodelāciju neatkarīgi no MYH mediētās šķiedru tipa maiņas. Fibroze iepriekš ir ziņota TNNT1 nemalīna miopātiju gadījumos.19 Tomēr mūsu analīze balstās uz šo atklājumu, atklājot arī paaugstinātu ekstracelulāro sekrēciju izraisītu olbaltumvielu, piemēram, aneksīnu, kas iesaistīti sarkolemmas atjaunošanās mehānismos, līmeni miofibrās no pacientiem ar ACTA1 un TNNT1 nemalīna miopātijām.57,58,59 Noslēgumā jāsaka, ka paaugstināts aneksīna līmenis miofibrās no pacientiem ar nemalīna miopātiju var liecināt par šūnu reakciju uz smagi atrofisku miofibru atjaunošanu.
Lai gan šis pētījums ir līdz šim lielākā vienas šķiedras pilna muskuļa-omikas analīze par cilvēkiem, tam ir arī ierobežojumi. Mēs izolējām skeleta muskuļu šķiedras no relatīvi neliela un homogēna dalībnieku izlases un viena muskuļa (vastus lateralis). Tāpēc nav iespējams izslēgt specifisku šķiedru populāciju esamību dažādos muskuļu tipos un muskuļu fizioloģijas galējos stāvokļos. Piemēram, mēs nevaram izslēgt iespēju, ka augsti kvalificētiem sprinteriem un/vai spēka sportistiem79 vai muskuļu neaktivitātes periodos66,80 var parādīties īpaši ātru šķiedru apakškopa (piemēram, tīras 2X šķiedras). Turklāt ierobežotais dalībnieku izlases lielums neļāva mums izpētīt dzimumu atšķirības šķiedru heterogenitātē, jo ir zināms, ka šķiedru tipu attiecības vīriešiem un sievietēm atšķiras. Turklāt mēs nevarējām veikt transkriptomiskās un proteomikas analīzes tām pašām muskuļu šķiedrām vai paraugiem no tiem pašiem dalībniekiem. Tā kā mēs un citi turpinām optimizēt vienas šūnas un vienas miofibras analīzes, izmantojot omikas analīzi, lai panāktu īpaši zemu paraugu ievadi (kā parādīts šeit, analizējot šķiedras no pacientiem ar mitohondriju miopātiju), kļūst acīmredzama iespēja apvienot multi-omikas (un funkcionālās) pieejas atsevišķu muskuļu šķiedru ietvaros.
Kopumā mūsu dati identificē un izskaidro skeleta muskuļu heterogenitātes transkripcijas un posttranskripcijas virzītājspēkus. Konkrētāk, mēs piedāvājam datus, kas apstrīd ilgstoši pastāvošu dogmu skeleta muskuļu fizioloģijā, kas saistīta ar klasisko, uz MYH balstīto šķiedru tipu definīciju. Mēs ceram atjaunot debates un galu galā pārskatīt mūsu izpratni par skeleta muskuļu šķiedru klasifikāciju un heterogenitāti.
Četrpadsmit baltās rases dalībnieki (12 vīrieši un 2 sievietes) brīvprātīgi piekrita piedalīties šajā pētījumā. Pētījumu apstiprināja Gentas Universitātes slimnīcas ētikas komiteja (BC-10237), tas atbilda 2013. gada Helsinku deklarācijai un bija reģistrēts vietnē ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Dalībnieku vispārīgās īpašības ir sniegtas 1. papildtabulā. Pēc mutiskas un rakstiskas informētas piekrišanas saņemšanas dalībniekiem pirms galīgās iekļaušanas pētījumā tika veikta medicīniskā pārbaude. Dalībnieki bija jauni (22–42 gadi), veseli (bez veselības problēmām, nesmēķēšanas vēstures) un mēreni fiziski aktīvi. Maksimālā skābekļa uzņemšana tika noteikta, izmantojot stepa ergometru fiziskās sagatavotības novērtēšanai, kā aprakstīts iepriekš.81
Muskuļu biopsijas paraugi tika savākti miera stāvoklī un tukšā dūšā trīs reizes ar 14 dienu intervālu. Tā kā šie paraugi tika savākti plašāka pētījuma ietvaros, dalībnieki 40 minūtes pirms biopsijas lietoja placebo (laktozi), H1 receptoru antagonistu (540 mg feksofenadīna) vai H2 receptoru antagonistu (40 mg famotidīna). Iepriekš esam pierādījuši, ka šie histamīna receptoru antagonisti neietekmē skeleta muskuļu fizisko sagatavotību miera stāvoklī81, un mūsu kvalitātes kontroles diagrammās (3. un 6. papildattēls) netika novērota ar stāvokli saistīta klasterizācija. 48 stundas pirms katras eksperimentālās dienas tika ievērota standartizēta diēta (41,4 kcal/kg ķermeņa masas, 5,1 g/kg ķermeņa masas ogļhidrātu, 1,4 g/kg ķermeņa masas olbaltumvielu un 1,6 g/kg ķermeņa masas tauku), un standartizētas brokastis (1,5 g/kg ķermeņa masas ogļhidrātu) tika patērētas eksperimentālās dienas rītā. Vietējā anestēzijā (0,5 ml 1% lidokaina bez adrenalīna) no muskuļa vastus lateralis tika iegūtas muskuļu biopsijas, izmantojot perkutānu Bergstrēma aspirāciju.82 Muskuļu paraugi tika nekavējoties ievietoti RNAlater un uzglabāti 4°C temperatūrā līdz manuālai šķiedru preparēšanai (līdz 3 dienām).
Svaigi izolēti miofibru kūlīši tika pārvietoti uz svaigu RNAlater barotni kultūras traukā. Pēc tam atsevišķas miofibras tika manuāli sadalītas, izmantojot stereomikroskopu un smalkas pincetes. No katras biopsijas tika atdalītas divdesmit piecas šķiedras, īpašu uzmanību pievēršot šķiedru izvēlei no dažādām biopsijas zonām. Pēc sadalīšanas katra šķiedra tika uzmanīgi iegremdēta 3 μl līzes buferšķīduma (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), kas satur proteināzes K un DNāzes enzīmus, lai noņemtu nevēlamus proteīnus un DNS. Šūnu līze un proteīnu/DNS noņemšana tika uzsākta ar īsu vorteksu, šķidruma centrifugēšanu mikrocentrifūgā un inkubāciju istabas temperatūrā (10 min). Pēc tam lizāts tika inkubēts termociklerā (T100, Bio-Rad) 37°C temperatūrā 5 minūtes, 75°C temperatūrā 5 minūtes un pēc tam nekavējoties uzglabāts -80°C temperatūrā līdz turpmākai apstrādei.
Ar Illumina saderīgas poliadenilētas RNS bibliotēkas tika sagatavotas no 2 µl miofibru lizāta, izmantojot QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Detalizētas metodes var atrast ražotāja rokasgrāmatā. Process sākas ar pirmās virknes cDNS sintēzi, izmantojot reverso transkripciju, kuras laikā tiek ieviesti unikāli molekulārie identifikatori (UMI) un paraugam specifiski i1 svītrkodi, lai nodrošinātu paraugu apvienošanu un samazinātu tehnisko mainīgumu apstrādes laikā. Pēc tam cDNS no 96 miofibriem tiek apvienota un attīrīta ar magnētiskām pērlītēm, pēc tam RNS tiek noņemta un otrās virknes sintēze tiek veikta, izmantojot nejaušus praimerus. Bibliotēka tiek attīrīta ar magnētiskām pērlītēm, tiek pievienotas grupai specifiskas i5/i7 atzīmes un tiek veikta PCR amplifikācija. Pēdējā attīrīšanas posmā tiek iegūtas ar Illumina saderīgas bibliotēkas. Katras bibliotēkas grupas kvalitāte tika novērtēta, izmantojot augstas jutības mazo fragmentu DNS analīzes komplektu (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Pamatojoties uz Qubit kvantifikāciju, grupas tika tālāk apvienotas ekvimolārās koncentrācijās (2 nM). Iegūtās grupas pēc tam tika sekvencētas ar NovaSeq 6000 instrumentu standarta režīmā, izmantojot NovaSeq S2 reaģentu komplektu (1 × 100 nukleotīdi) ar 2 nM piesātinājumu (4% PhiX).
Mūsu cauruļvads ir balstīts uz Lexogen QuantSeq Pool datu analīzes cauruļvadu (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Dati vispirms tika demultipleksēti ar bcl2fastq2 (v2.20.0), pamatojoties uz i7/i5 indeksu. Pēc tam 2. nolasījums tika demultipleksēts ar idemux (v0.1.6), pamatojoties uz i1 parauga svītrkodu, un UMI sekvences tika iegūtas ar umi_tools (v1.0.1). Pēc tam nolasījumi tika apgriezti ar cutadapt (v3.4) vairākās kārtās, lai noņemtu īsus nolasījumus (<20 garumā) vai nolasījumus, kas sastāvēja tikai no adaptera sekvencēm. Pēc tam nolasījumi tika saskaņoti ar cilvēka genomu, izmantojot STAR (v2.6.0c), un BAM faili tika indeksēti ar SAMtools (v1.11). Dublikātu nolasījumi tika noņemti, izmantojot umi_tools (v1.0.1). Visbeidzot, izlīdzināšanas skaitīšana tika veikta, izmantojot featureCounts Subread (v2.0.3). Kvalitātes kontrole tika veikta, izmantojot FastQC (v0.11.9) vairākos cauruļvada starpposmos.
Visa turpmākā bioinformātikas apstrāde un vizualizācija tika veikta programmā R (v4.2.3), galvenokārt izmantojot Seurat (v4.4.0) darbplūsmu.83 Tādēļ atsevišķas UMI vērtības un metadatu matricas tika pārveidotas Seurat objektos. Gēni, kas ekspresēti mazāk nekā 30% no visām šķiedrām, tika noņemti. Zemas kvalitātes paraugi tika noņemti, pamatojoties uz minimālo slieksni 1000 UMI vērtības un 1000 atklātos gēnus. Galu galā 925 šķiedras izturēja visus kvalitātes kontroles filtrēšanas soļus. UMI vērtības tika normalizētas, izmantojot Seurat SCTransform v2 metodi,84 iekļaujot visas 7418 atklātās pazīmes, un starp dalībniekiem radušās atšķirības tika regresētas. Visus attiecīgos metadatus var atrast 28. papildu datu kopā.